Устройство для определения проницаемости модельных биологических мембран Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

Г) 05

4 1 Изобретение относится к биофизике, а именно к устройствам для определения проницаемости модельных биологических мембран, и может служить для исследования проницаемости различных биологически активных соединений. Известно устройство для определе ния проницаемости бимолекулярных фосфолипидных мембран для антибиоти ков и ионофоров, заключающегося в сведении исследуемой мембраны и мембраны электрода .f 1;I. Известно также устройство для определения проницаемости бимолекулярных фосфолипидных мембран для антибиотиков и разобщителей окислительного фосфорилирования, состоящее из измерительной ячейки, содерж щей два соизмеримых рабочих отсека с измерительными электродами, моста сопротивлений, регистратора 2 J. Недостатками известных устройств являются низкая точность, ограниченный круг соединений, проницаемость которых, можно изучать, а также невозможность определения проницаемости для нескольких мембран. Целью изобретения является сокра щение времени, повьвоение точности при определении проницаемости двух и более мембран. Поставленная цель достигается те что в устройстве для определения Проницаемости модельных биологических мембран, содержащем ячейку с разделительной мембраной, измерительные обратимые электроды, расположенные по обе стороны мембраны, измеритель электрической проводимос ти и регистрирующее устройство, при этом в ячейке установлен ряд дополнительных отсеков с мембранами, при чем объем каждого последующего отсе ка составляет 0,005-0,5 объема предьщущего, а измерительный обратимый электрод расположен в каждом отсеке и подключен через коммутатор к измерителю электрической проводимости На фиг. 1 изображено устройство, общий вид и измерительная ячейка, разрез; на фиг. 2 - зависимость рос та электропроводности от времени; на фиг. 3 - зависимость электропроводности от концентрации, на фиг,А рост концентрации во времени. Проведение измерений с помощью предлагаемого устройства проводится по схеме (фиг.1) для изучения трех 441 последовательно расположенных мембран 1-3. Измерительная ячейка состоит из нескольких разньк размеров тефлоновых стаканчиков 5-7, которые плотно вставляются один в другой так, чтобы отверстия для посадки мембран были расположены концентрически. Затем наружный тефлоновый стакан 5 плотно вставляется в стаканчик из оргстекла 4 с плоской и прозрачной стенкой, что позволяет наблюдать за всеми исследуемыми мембранами г отраженном свете с помощью микроскопа. Все отсеки рабочей ячейки 10-13 заполняются одинаковой средой и разделяются исследуемыми мембранами 1-3. В первый отсек ячейки 10 вводится раствор соли исследуемого ионофора известной концентрации С и наблюдается измерение проводимости всех исследуемых мембран. Величина проводимости каждой из последующих 2, 3 и т.д. мембран однозначно определяется концентрацией ионофора во втором 11, третьем 12 и т.д. отсеках рабочей ячейки. Таким образом, ионы ионофора, диффундируя через первую исследуемую мемйрану 1, попадают во второй отсек ячейки 11, создавай со временем определенную концентрацию С- ионофора во втором отсеке, затем диффундируя через вторую мембрану, создают определенную концентрацию ионофора Cj в третьем отсеке ячейки и т.д. Изменение концентраций исследуемого ионофора по другую сторону мембраны описывается следующим кинетическим уравнением где С, концентрация ионофора в первом отсеке измерительной ячейки; « 7 соответственно 1-й и 2-й объемы отсеков ячейки; площадь мембраны, время измерений, коэффициент проницаемости мембраны. Поэтому в целях уменьшения времени достижения равновесных концентраций ионофора, добавленного в первый отсек ячейки, во всех остальных отсеках ячейки каждый последующий отсек рабочей ячейки изготовляется в 10-20 раз меньше относительно предшествующего. Определение электропроводности модельных липидных мембран проводится с помощью хлорсеребряных электродов 9, опущенных в водные растворы, и электрической схемы, состоящей из коммутатора 14, моста 15 сопротивлений и регистратора 16. Коммутатор 14 позволяет переключать мост сопротивлений на каждую из исследуемых мембран и сопоставлять сопротивление мембраны с каким-либо из стандартных сопротивлений из моста сопротивлений Сопротивление мембраны определяется из -известного выражения ил и-и где сопротивление мембраны; Rj - стандартное сопротивление эквивалента; и - напряжение включенного в цепь источника} 1и падение напряжения на мембране. С помощью известного сопротивления находится удельная проводимость 1 (где g - удельная мембраны g проводимость, S - площадь мембраны) Измеряемь:е характеристики мембран регистрируются с помощью автоматичес ких потенциометров. Водные растворы во всех отсеках рабочей ячейки интен сивно перемешиваются с помощью магнит ной мешалки и Т-образных мешалок 8, НОЖКИ которых вставляются в специальные углубления на дне отсеков. Каждая из исследуемых мембран предва рительно калибруется в тех же условиях перемешивания в отсутствие остальных мембран, т.е. строится график зависимости электропроводности мембран g данного состава от концентрации ионофора С. Зная значения электропроводностей мембран g в данный момент времени t, по этим калибровочным графикам определяются концентрации ионофора в этот момент времени во втором С., третьем С и последующих отсеках ячейки. Удель ный поток ионофора через исследуемую мембрану площади S определяется из выражения I (где V,, о« с объем п-го отсека ячейки). Коэффици ент проницаемости Р определяется из выражешя Р .s р /..s Пример. Проводят измерения индуцируемых тетрахлор-2-трифторметилбензимидазолом (ТТФБ) электрических проводимостей модельных липидных мембран, сформированных из яичного лецитина в концентрации 50 мг/мл н-декана (первая мембрана), и-з общих липидов мозга в концентрации 20 мг/мл н-декана (вторая мембрана) , из окисленного холестерина в концентрации 50 мг/мл н-декана (третья мембрана), причем вторая мембрана является для первой мембраны одновременно и мембраной-электродом, также как и п-я для (п-1)-ой мембраны. На фиг. 2 показана экспериментально выявленная зависимость роста электропроводности g мембраны (вторая мембрана на фиг.1), сформирован ной из общих липидов мозга, от времени t при внесении в первый рабочий отсек 10 с раствором 0,05 М бор-, ной кислоты ТТФБ до конечной концентрации 8 - 10.М.. На фиг. 3 показана эксперим нтально выявленная зависимость электропроводности g мембраны (вторая мембрана на фиг.1), сформированной из раствора общих липидов мозга, от концентра1Д1и С ТТББ в растворе 0,05 М борной кислоты в присутствии остальных исследуемых мембран (калибровочная зависимость). На фиг. 4 показан экспериментально выявленный рост концентрации Cj. ТТФБ. во втором рабочем отсеке, II измерительной ячейки во времени t при наличии всех трех исследуемых мембран 1-3. Зная значения электропроводности мембран g в данный момент времени t (фиг.2), по калибровочной зависимости (фиг.З) определяется количество ионофора, в Данном случае ТТФБ, прошедшее через первую исследуемую мемб рану, т.е. концентрация ионофора во втором рабочем отсеке. Описанный подход применяется и к последующим мембранам. Как видно из фиг. 4, экспериментально выявленные зависимости роста концентрации ТТФБ от времени - линейны, что является критерием применимости предлагаемого метода измерений.

511096446 .

Такое вьтолнение устройства бильностиусловий эксперимента и

позволяет повысить точность про- сократитьсроки измерений до трех ведения измерений благодаря, ста- часов.

УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕтм ПРОНИЦАЕМОСТИ МОДЕЛЬНЫХ БИШОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН, содержащее ячейку с разделительной мембраной, измерительные обратимые электроды, расположенные по обе стороны мембраны, измеритель электрической проводимости и регистрирующее устроГство, отличающееся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени при определении проницаемости двух и более мембран, в ячейке установлен ряд дополнительных отсеков с мембранами, причем объем каждого последующего отсека составляет 0,005-0,5 объема предыдущего, а измерительный обратимый электрод расположен в каждом отсеке и подключен через коммутатор к измерителю эл ектрич ее кой пр оводимос ти,

15

i:

I

/4ож1У,6м/см

о ts

/, м/см2

fO9

fO7fff-ffffS

0ttt3

1109644

A

30

60

U9 i

10

CzJf n/t

0

1020УО

ФигЛ

tfMUH

ite