СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ ИСКУССТВЕННЫХ И НАТИВНЫХ БИМОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕМБРАН ДЛЯ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/74 G01N33/48 

Изобретение относится к биологии, конкретно к области биохимии клеточных мембран, и может быть использовано в медицине, биохимии и фармакологии для определения степени участия стероидных гормонов во внутриклеточном метаболизме в состоянии нормы и патологии.

Наиболее близким аналогом является метод формирования бимолекулярных липидных мембран (БЛМ) по Мюллеру (Mueller P., Rudin D.O., Tien H.Ti., Wescott H. H., 1963), который используется для измерения ионной проводимости биомембран.

В современной литературе имеются сведения о проницаемости биомембран для ионов и отсутствуют сведения о применении метода Мюллера для измерения проницаемости плазматических мембран тканей-мишеней для стероидных гормонов.

Для определения ионной проницаемости мембран используется установка, предложенная Мюллером, но при работе на этой установке с веществами стероидной природы возникает ряд сложностей:
1) во-первых, тонкая мембрана разрушается при отборе проб раствора с проникшими стероидами;
2) во-вторых, требуется установление одинакового гидростатического давления в обеих камерах с целью предотвращения гидростатического разрыва мембраны.

Целью изобретения является определение величины проницаемости искусственных и нативных бимолекулярных мембран для стероидных гормонов.

На чертеже представлена конструкция устройства для определения проницаемости искусственных и нативных бимолекулярных мембран для стероидных гормонов с нашими дополнениями.

Поставленная цель достигается тем, что:
1) для того, чтобы тонкая бимолекулярная мембрана не разрушалась при отборе проб раствора с проникшими стероидными гормонами из коллекторной камеры 2 устройства, на перегородке 3 сделаны специальные заслонки 6 и 7, изготовленные из текстолита с резиновым покрытием и имеющие подвижные закрепления 8 на перегородке 3.

Эти заслонки позволяют по истечении времени экспозиции, за которое измеряется проницаемость мембраны, перекрыть сообщение между эмиттерной 1 и коллекторной 2 камерами:
2) для установления одинакового гидростатического давления между камерами 1 и 2, необходимого для устойчивости мембраны, было сделано сообщение между ними посредством соединительной трубки 9 с вентилем 10.

Проницаемость мембраны для любого химического вещества P рассчитывается по известному уравнению Фика (Рубин А.Б., 1987):

где P - проницаемость мембраны, см/с;
d_m - масса частиц, моль;
S - площадь мембраны, см²;
d_t - время экспозиции, с;
C1 - концентрация исследуемого стероидного гормона в змиттерной камере, фмоль/мл;
C2 - концентрация исследуемого стероидного гормона в коллекторной камере, фмоль/мл.

Для формирования БЛМ используется установка, конструкция которой приведена на чертеже. Ячейка из плексигласа состоит из эмиттерной 1 и коллекторной 2 камер, разделенных полиэтиленовой перегородкой 3, в которой сделано отверстие 4 диаметром 1 мм, предназначенное для формирования БЛМ. Внутри обеих камер находятся хлорсеребряные электроды 5, Для закрывания отверстия 4 в перегородке 3 со стороны эмиттерной 1 и коллекторной 2 камер используются задвижки 6 и 1 соответственно, имеющие подвижные закрепления 8 на перегородке 3. Для уравновешивания гидростатического давления в обеих камерах используется система гидростатического уравновешивания, состоящая из U-образной трубки 9 с перекрывающим вентилем 10. Левый электрод 5 соединен с генератором 11 низких частот, а правый - с осциллографом 12.

В качестве препарата искусственных мембран используется раствор яичного фосфатидилхолина в н-октане (20 мг/мл); трис-буфер (20 ммоль/л основной трис, 25 ммоль/л KCl, 1.5 ммоль/л ЭДТА, 10 ммоль/л NaMoO₄ и 10% глицерин, pH 7,4, значение pH устанавливается добавлением концентрированной HCl); в качестве препарата нативных мембран используется препарат мембран мышечных клеток белых крыс, полученных методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. В качестве стероидного гормона используется радиоактивный [1,2,6,7-³Н]-кортикостерон с удельной активностью 79 Ки/ммоль.

Способ определения проницаемости искусственных и нативных БЛМ осуществляется следующим образом:
В исходном состоянии в устройстве задвижки 6, 7 и вентиль системы гидростатического уравновешивания 10 закрыты.

В эмиттерную камеру 1 вносят 8 мл трис-буфера (pH 7.4), содержащего ³H - кортикостерон в концентрации 5.5 пмоль/мл (550000 имп/мин/мл), что соответствует физиологической концентрации стероида в крови, а в коллекторную 2 - 1.5 мл трис-буфера.

Для установления гидростатического равновесия в обеих камерах вентиль 10 открывается на 1 мин.

Процесс формирования БЛМ начинается с перекрывания вентиля 10, затем в эмиттерную камеру 1 подается пилообразное напряжение с генератора 11 амплитудой 100 мВ и частотой 10 кГц. При этом на экране осциллографа 12 наблюдается нулевая линия, свидетельствующая о надежном перекрытии обеих камер. После этого открывается задвижка 7 и на отверстие в перегородке 4 со стороны коллекторной камеры 2 с помощью стеклянной пипетки с изогнутым носиком наносится капля раствора фосфатидилхолина для образования искусственных бимолекулярных мембран и для образования нативных бимолекулярных мембран наносится капля препарата нативных плазматических клеточных мембран миоцитов белых крыс в среде хранения (25% по объему глицерина, 0,2 ммоль/л CaCl₂, 0.1 ммоль/л ЭДТА, 20 ммоль/л трис), после чего открывается задвижка 6. Через 10-30 с на осциллографе наблюдается напряжение прямоугольной формы, что свидетельствует об образовании БЛМ. С этого момента начинается отсчет времени проникновения (время экспозиции) исследуемого вещества (³Н-кортикостерона) через БЛМ. Время измерения проникновения стероида в экспериментах составляет: 1, 5, 10, 15, 20 мин. По окончании времени измерения закрывается сначала задвижка 7, затем задвижка 6, после этого раствор из коллекторной камеры 2 отбирают пипеткой по 1.5 мл в сцинтилляционные виалы, содержащие по 7.5 мл толуолового сцинтиллятора ЖС-107 для измерения радиоактивности. Регистрация радиоактивности осуществляется в жидкостно-сцинтилляционном счетчике Mark III (Tracоr-Europa, USA). Затем следует 4-кратная отмывка коллекторной камеры 2 дистиллированной водой. После этого установка является готовой к проведению следующего цикла измерений. Для каждого времени экспозиции 1, 5, 10, 15, 20 мин проводится пять циклов измерений. Результаты эксперимента по измерении проницаемости для искусственных и нативных бимолекулярных липидных мембран приведены в таблице.

Полученные результаты статистически обрабатываются методом наименьших квадратов по стандартным статистическим компьютерным программам, величина проницаемости вычисляется по формуле Фика.

Пример расчета величин проницаемости.

Для искусственных и нативных мембран принимается приближение линейной регрессией, согласно формуле y = a + bx.

Подставляя в формулу Фика числовые показатели параметров и результатов эксперимента, имеем:
dm/dt = b/60 - угол наклона прямой линейной регрессии, фмоль/с;
S = 0,01 см² - площадь мембраны;
C1 - C2 = 5500 фмоль/мл - разница концентраций ³Н-кортикостерона между эмиттерной и коллекторной камерами.

Для искусственных мембран: а = 0.048 ± 0.14; b = 0.25 ± 0.01
откуда:

Для нативных мембран: а = 0.006 ± 0.42; b = 2.12 ± 0.03
откуда:

(p < 0,05).

Предлагаемым способом было получено, что проницаемость искусственных бимолекулярных липидных мембран (БЛМ) из фосфатидилхолина для кортикостерона составляет (7.7 ± 0.4)•10^-5 см/с, для нативных мембран мышечных клеток белых крыс - (7.1 ± 0.1) • 10^-4 см/с.

Изобретение может быть использовано в медицине, а именно в эндокринологии для определения проницаемости нативных и искусственных бимолекулярных мембран для стероидных гормонов. Способ предусматривает воздействие переменного тока на бислойную липидную мембрану (БЛМ), которую формируют из раствора фосфатидилхолина и нативных плазматических мембран миоцитов белых крыс, и дальнейшее определение проницаемости по времени проникновения исследуемого вещества. Устройство для осуществления способа включает ячейку из плексигласа, содержащую эмиттерную и коллекторную камеры, разделеные полиэтиленовой перегородкой с отверстием для формирования БЛМ, хлорсеребряные электроды, находящиеся внутри обеих камер, осциллограф, соединенный с правым электродом, генератор низких частот, соединенный с левым электродом, задвижки для закрытия отверстия в перегородке со стороны эмиттерной и коллекторной камер и систему гидростатического уравновешивания гидростатического давления в обеих камерах в виде U-образной трубки с перекрывающим вентилем. Изобретение позволяет определить степень участия стероидных гормонов во внутриклеточном метаболизме. 2 с.п.ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Способ определения проницаемости искусственных и нативных бимолекулярных мембран для стероидных гормонов, включающий воздействие переменного тока на бислойную липидную мембрану (БЛМ) и дальнейший расчет проницаемости по формуле, отличающийся тем, что БЛМ формируют из раствора фосфатидилхолина и нативных плазматических мембран миоцитов белых крыс, проводят определение по времени проникновения исследуемого вещества. 2. Устройство для определения проницаемости искусственных и нативных бимолекулярных мембран для стероидных гормонов, включающее ячейку из плексигласа, содержащую эмиттерную и коллекторную камеры, разделенные полиэтиленовой перегородкой с отверстием для формирования БЛМ, хлорсеребряные электроды, находящиеся внутри обеих камер, осциллограф, соединенный с правым электродом, генератор низких частот, соединенный с левым электродом, задвижки для закрывания отверстия в перегородке со стороны эмиттерной и коллекторной камер и систему гидростатического уравновешивания гидростатического давления в обеих камерах в виде U-образной трубки с перекрывающим вентилем.