Способ определения мембранотропной активности полиеновых антибиотиков Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии и биофизике и может быть использовано в фармакологии, микробиологии и экспериментальной медицине.

Цель изобретения - повышение точности оценки биологической эффективности при моделировании биологического действия мембранотропного вещества на искусственной бимолекулярной липидной мембране (БЛМ).

Способ осуществляется следующим образом.

Формируют бислойную липидную мембрану на отверстии в тефлоновой ячейке, разделяющем водно-солевые растворы, вводят в нее исследуемое вещество и измеряют индуцированную проводимость. После достижения стационарной проводимости от14ывают исследуемое вещество из одного из растворов, регистрируют кинетику релаксации проводимостиS определяют постоянную времени релаксации и по ее величине определяют эффективность исследуемого вещества in vivo.

Пример, Измерение электрических характеристик мембраны проводят в режиме фиксации потенциала с помощью усилителя 45-9,

Напряжение Ug от источника регулируемого напряжения подается через электрод на мембрану. Ток через мембрану подается через экранированный электрод на вход электрометрического усилителя, где преобразуется в сигнал выходного напряжения U.

Ток вычисляется по формуле

I НЁ-Ч о ос

где R - сопротивление обратной связи Удельная проводимость вычисляется по формуле

g

1 UB,, RS и

ex

где S - площадь мембраны,

Сигнал выходного напряжения усилителя подается на самописец и регистрируется на диаграммной ленте. Четы- рехканальный перистальтический насос подает по трубке отмывочный раствор содержащий сахарозу, ко дну стеклянной кюветы (объем 12 мл). Легкий исходный раствор отсась вается сверху. В результате происходит замена исходного раствора с антибиотиком раствором, не содержащим антибиотик. При этом условия в тефлоновой .ячейке (объем 1 мл) неизменны. После прохож

0

5

0

5

0

5

O

5

дения границы раздела растворов через мембрану концентрация антибиотика во внешнем (отмываемом) растворе скачком падает до нуля. Момент прохождения фиксируется визуально так как растворы имеют разную плот- носогь и разный показатель преломления,, Если подавать тяжелый отмывочный раствор сверху, то происходит перемешивание растворов, концентрация антибиотика вблизи мембраны меняется сложным нерегулярным образом, что приводит к искажению кинетики релаксации и неопределенности f.

Состав мембраны фосфолипиды/холес- терин 0,5. Солевой раствор 10 мм КС1„ рН 6, t 23°С, Вводят 1,7-10 метамфоцина. После достижения стационарной проводимости отмывают внещнюю сторону мембраны раствором 10 мм КС1+ 4- 10% сахарозы.

Мембрану формируют следующим образом ,

На отверстие вымытой и высушенной ячейки наносят каплю липидного раствора и высушивают. Это необходимо для лучшего сцепления мембраны с краями отверстия. Затем ячейку вставляют в стеклянную кювету, заливают солевьЕг ми растворами и под контролем в роскоп (MGC2) из пипетки, смоченной липидным раствором, выдувают на отверстии пузырек воздуха. Первоначально липидная пленка на отверстии имеет значительную толщину и на ней в отраженном свете в микроскоп видна интерференционная картина (Кольца Ньютона) , По мере утоньшения пленки (рас- тексшия) ее толщина становится меньше длины волны, и интерференционная картина исчезает. Из маточного раствора антибиотика 10 М в ДМСО или дистиллированной воде вводят в солевые растворы в требуемом количестве микрошприцом и перемешивают магнитной мешалкой. Регистрируют кинетику проводимости и после достижения ее cтau oнapнoгo уровня gs производят отмывку. Момент начала отмывки регист-- рируют визуально в микроскоп. Регистрируют кинетику релаксации проводимости и с.троят график в координатах Ig g/gS tj причем началу отсчета времени соответствует момент начала отмывки.

Для определения f на линейном участке графика могут быть выбраны произвольные моменты времени t,

«« У/)- + b

у ах, + b

и tj , t, 24 мин, tj 30 мин, 1ё 0,84 взяты ля конкретно варианта расчета.

Как известно из аналитической гметрии, уравнение прямой + Ь, где а - тангенс угла наклона прямо

Пусть заданы две точки прямой (х,, у, ), (х.

Тогда у, ах,

откуда

а XI-I-ZL. ,/а 2z.:.5L. 2 1 Уг У|

Релаксация проводимости описыва ся уравнением

g k. или

Ig g/gs Igk - t/t-, т.е. получают линейную зависимость с угловым коэфициентом - iT .

Отсюда и следует формула для определения Т :

tj I t.

O lg gT/gT Величину Ig 0,84 получают из

г

Составитель Н.Кузенкова Редактор А.Козориз Техред Л.Олейник Корректор А.Ференц

Заказ 2446/45 Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. А/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

графика Ig g(t)/gs при t 24 мин, tj 30 мин.

Отсюда получают - 30-24 ,. 273-0784 3 мин.

Таким же образом по кинетическим кривым определяются все остальные значения Г.

Повторяют указанную процедуру в диапазоне концентраций 5-10 -3 10 М.

Для сравнения эффективности антибиотика мембраны животных клеток моделируют составом холестерин/фосфо- липиды в весовом соотношении 1:2, а клетки грибов - эргостерин/фосфолнпи- ды 1 :20. При этом получают -1,5 ннн , и 30 мин при концентрации метам ,фоцина 10 М.

Для сравнения эффективности различных антибиотиков для мембран состава холестерин/фосфолипиды 0,5 и концентраций амфотерицина Ви и его аналога АВ4 (условное название) 510 М определяют 10 мин соответственно.