Транс-2,3,11,12-(4,4-диамил)- дибензо-18-корона-6 в качестве избирательного индуктора калиевой проницаемости биологических и искусственных мембран Советский патент 1980 года по МПК C07D323/00 A61K31/335 A61P3/12 

Изобретение относится к новому химическому соединению - транс-2,3, 11,12- (4, 4 -диамил) -дибензо-18-корона-6, которое может найти применение 5 в биологии и медицине в качестве избирательного иднуктора калиевой проницаемости мембран.

Известны природные индукторы ионной проницаемости мембран, в частнос-10 ти антибиотики группы нактина, валиномицин, грамицидин ИОднако природные ионофоры, несмотря на ряд преимуществ, химически Мсшоустойчивы и труднодоступны. 5

Известны также синтетические ионофоры - диацильные производные 2,3,11,12-18-короны-6, в частности транс-2 ,3,11,12- (4, 4 -дивалерил) -дибензо-18-корона-6 2 .20

Указанное соединение является преимущественно индуктором проницаемости биологических мембран по двухвалентным катионам {Са , Мд ), а кроме того, характеризуется низкой 25 избирательностью по отношению к иону калия, индуцирует транспорт ионов только через биологические мембраны, менее активен по действующей концентрации (в 100 раз) и плохо раство- ЗО

РИМ в спирте, что ограничивает сферу его применения.

Новое соединение - тр1анс-2 , 3 ,11, 12- (4, 4 -диамил) -дибензо-18-короны-6 общей формулы 1,способное эффективно и избирательно увеличивать калиевую проницаемость как биологических,так и искусственнь1Х мембран подвергают восстановлению по Клемменсону.

Структура полученного соединения доказана данными ИК-, ЯМР и массспектроскопии.

Синтезированное соединение формулы- 1 способно давать комплексы с ионами щелочных металлов и избирательно индуцирует транспорт ионов калия как через биологические, так и искусственные мембраны.

Пример 1. Синтез транс-2,3, 11Д2-(4,4 -диамил)-дибензо-18-короны-6.I ,,

Берут 1 г транс-2,3,11 Д2-(4,4 дивалерил)дибенао-18-короны-6, 1,3 г амальгамированного цинка, 2,4 мл концентрированной соляной кислоты, 0,5 мл воды и 50 мл этилового спирта, кипятят в течение 40 ч, добавляя каждый час по 0,2 мл концентрированной соляной кислоты, смесь декантируют с непрореагйровавшего цинка и отгоняют спирт, добавляя воду. Выделившееся масло экстрагируют хлороформом, промьшают водой до нейтральной реакции, сушат СаСбт н растворитель удаляют.

Продукт реакции очищают колоночной хроматографией в системе гексанхлороформ-ацетон - 3:2:0,5 и последовательной кристаллизацией из гексана и ацетона. Выход 0,5 г (53%), т.пл.111-113°С.

Найдено, % С 72,18, Н 9,24, М.в.БОО,

. io 44 t Вычислено,% С 71,97; Н 8,86; М.В. 500,6.

ЯМР-спектр (м,д.): 6,5-6,8 (бН,м, АгН); 3,8-4,2 (16Н,м,,ОСНк); 2,48 (4H,T,-CHj); l,00-i;70 (12Н,м,С-СН4); 0,82 (6Н,Т, С-СН).

ИК-спектр, см : 15 95,1520 ); 2950-2870, 1270-1150 (-С-О-С-); 870, 810 (1,2,4 - замещенный бензол).

Пример 2. Специфику проницаемости, индуцируемой транс-2 ,3 ,11, 12(4,4 -диамил)-дибензо-18-короноЙ-6 на биологических и искусственных мембранных системах, исследуют на митохондриях и бислойных фосфолипидных мембранах (БФМ), которые являются классическими объектами для тестирования мембраноактивных свойств различных соединений.

Митохондрии печени крыс выделяют методом дифференциального центрифугирования. Проницаемость внутреннихмембран этих субклеточных органелл определяют по скорости снижения оптической плотности суспензии при 520 нм на фотометре ЛКФ-69, к выходу которого подключали самописец QH-102, Измерения проводят при перемешивании в стеклянных кюветах с длиной оптического пути 1 см. Инкубационные среды объемом 3 мл содержат во всех случаях ингибиторы дыхания - ротенон и антимицин (по 0,33 мкг/мл) и 10 мм триснитрата (рН 7,45); кроме этих компонентов среды содержат 130 мм нитрата калия или натрия, либо аммония (при измерении проницаемости по Н), или 86 мм нитрата кальция, или магния или бария.

Таким образом, энергозависимое на- ухание митохондрий, обладающих свойтвами осмометров, лимитируется только скоростью трансмембранного переоса исследуемого катиона, поскольку итрат является анионом, проникающим ерез мембраны митохондрий. Использоанные препараты этих органелл харакеризуются низкой проницаемостью по сем катионам, исключая Са, который ранспортируется внуть митохондрий с ысокой скоростью при помощи специфиеского эндогенного кальциевого пе.пв осчика.

Проницаемость для различных катионов оценивают по скорости набухания митохондрий, которую измеряют.в Л . в кювету со средой инкубации добавляют митохондрии (1,1-1,2 мг белка на 3 мл среды) и регистрируют скорость уменьшения оптической плотности в течение 1 мин. Затем в кювету вносят в зависимости от исследуемой концентрации 15-150 мкл спиртового раствора циклополиэфира и продолжают регистрацию еще 2-3 минуты. Контролем служат пробы, в которые вносят только соответствующий объем эталона.

Результаты исследований показывают ( табл.1) , что транс-2,3,11,12-(4,4 -диамил)-дибензо-18-корона-6 в низких концентрациях (2, -IxlCf M) индуцирует проницаемость митохондриальных мембран преимущественно для ионов К, в меньшей мере - для Na не действуя даже при использовании существенно более высоких концентраций (5-1010 м) на скорость переноса двухвалентных катионов, в присутствии М соединения 1 проницаемость митохондрий по Na увеличивается в 1,3 раза, по в 2 раза, в то время как по К - в 20 раз. Более высокие концентрации циклополиэфира ( - () индуцируют общее увеличение проницаемости митохондрий для одновалентных катионов, однако проницаемость по К , по-прежнему, остается в несколько раз выше, чем для Н и Na . Так, относительная проницаемость митохондрий для калия, водорода и натрия индуцированная 1«10-5м транс-2 , 3 ,11,12 (4, 4 -диамил) дибензо-18-короной-6 составляет соответственно 1,0,46 и 0,075 (прирост проницаемости для калия принят за 1). С увеличением концентрации соединения 1 в .диапазоне 2, I-lCf M калиевая проницаемость мембран митокондрий увеличивается линейно.

Таблица 1

Влияние различных концентраций транс-2, 3,11,12-(4, 4 -диамил) -дибензо-18-короны-6 на проницаемость мембран митохондрий для некоторых одно- и двухвалентных катионов (А - проницаемость в присутствии циклополиэфира. Ад - в контроле)

0,25 4,7 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,5 7,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 i Продолжение табл. 11 0,75 10,7 1,0 1,1 1,01,01,0 1,0 20,0 1,9 1,3 1,01,2l,q 5,0 42,4 15,6 2,5 1,01,8.1,0 10,0 80,0 36,7 , 6,2 1,12,81,6 50,0 - 49,8 14,6 0,5 2,8 1,0 100,0 - - - 0,5 1,7 1,0 Эффекты, оказываемые синтезированным циклеполизфиром, на митохондриях, коррелируют с данными, полученными на бислойных фосфолипидных мембранах. .БФМ из липидов белого вещества мозга быка формируют на отверстии диаметром 1 мм в тефлоновом стаканчике, помещенном в стеклянную кювету с буферным раствором: 25 мм трис-НСб (рН 7,4). Мембранообразующий раствор содержит 20 мг фосфолипи дов мозга в 1 мл декана. Параметры БФК измеряют при помощи хлорсеребряных электродов, подключенных к электрометру ОР-205.Эксперименты, выполненные на ВМФ показывают, что транс-2 , 3 ,11,12-(4, 4 диамил)-дибензо-18-корона-6 индуциру ет проводимость бислоев, состоящую из калиевой и протонной компоненты. При использовании синтезированного циклополизфира проводимость БФМ по Н увеличивается в 2,5 раза, а по К - в 7,5 раз, т.е. имеет мест общее снижение сопротивления в 10 ра При создании на мембране 10-кратного калиевого градиента генерируется мембранный потенциал, равный 58 мВ, т.е. циклополиэфир придает фосфолипидной мебране свойства калиевого электрода. Вместе с тем, даже при использовании соединения 1 в концентрации IxlO M не наблюдается индукци проводимости бислоев для ионов кальция. Катионную специфичность предлагаемого соединения, по ионам калия или натрия оценивают путем добавления с одной стороны БФМ 10 мМ К, а с другой - 10 мМ Na . В присутствии IxlO M транс-2,3,11,12-(4,4 диамил)-дибензо-18-короны-6 в этих условиях на мембране генерируется разность потенциалов, равная 59 мв. Отсюда следует, что константа катионной спедифичности К, Na равна 10. Пример 3. Эффективную концентрацию транс-2 , 3,11,12-(4,4 -диамил)-дибензо-18-короны-6, индуциру тщую калиевую проницаемость, определяют на биологических мембранах (митохондрии) и модельных системах(липосомы и БФМ). Проницаемость митохондрий и БФМ по К измеряют как и в примере 2. Липосомы готовят из 10% спиртового раствора яичного лецитина путем его диализа против водного раствора, содержащего 30 мМ КСВ и 30 мМ трис-хлорида (рН 7,4) с трехкратной сменой буфера в течение 24 ч. Кинетику выхода ионов калия из липосом регистрируют с помощью стеклянного электрода ЭСЛ-51Г-04 в комплексе с лабораторным рН-метром рН-340, к выходу которого подключают самописец КСП-4. Шкалу регистратора ксшибруют раствором КСЕ известной концентрации Данные, представленные в табл.2 показывают, что существует прямая пропорциональная зависимость между используемой концентрацией циклополиэфира и индуцируемой им калиевой проницаемостью на всех исследованных объектах. 5-10-кратное увеличение проводимости по К достигают добавлением к мембранным структурам предлагаемого соединения в конечной концентрации 5)10 М, что в 100 раз меньше концентрации, в которой проявляются мембраноактивные свойства его прототипа. Таблица 2 Эффект различных концентраций транс-2,3,11,12-(4, 4 -диамил)-дибензо-18-короны-б на калиевую проницаемость митохондрий, липоСом и бислойнкх фосфолипидных мембран Представлена проводимость БФМ в присутствии 10 мМ К. На основании полученных результатов транс-2,3,11,12- (4, 4 -диамил)-дибензо-18-корона-6 является избирательным индуктором калиевой проницаемости всех типов мембран, в 10б раз активнее известных (2) по действующей концентрации, хорошо растворим в спирте , в связи с чем более удобеи для исследования иа биологических объек- тах и может быть использован в качестве инструмента при изучении механизмов транспорта ионов кгшия через

биологические и искусственные мембраны, а также для изготовления на его основе калий-чувствительных электродов для измерения активности ионов ксипия в жидких средах.

S Формула изобретения

Транс-2,3,11,12- (4, 4 -диамил) -ди iHSo-ie-jfojJoHa-e формулы 1

в качестве избирательного индуктора калиевой проницаемости биологических и искусственных мембран.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Овчинников Ю.А., Иванов В.Т., Шкроб A.M. Мембраноактивные комплексоны. М., Наука г 1974.

2.Авторское свидетельство СССР по заявке 2393378/23-04,

кл. С 07 О 323/00, 02.08.76,