Способ диагностики острой стадии вирусного гепатита Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 G01N33/48 

в

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОЙ СТАДИИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА путем исследования ферментативной активности сыворотки крови, отличающийс я тем, что, с целью повьшения точности способа, определяют активность фермента L -треонин- L, -серин-дегидротазы и при её наличии диагностируют острую стадию вирусного гепатита.

N( «

00 Изобретение относится к клинической биохимии, в частности к энзимодиагностике заболеваний печени. Известен способ диагностики острой стадий вирусного гепатита путем исследования ферментативной активнос ти сьгооротки крови Однако известный способ характери зуется недостаточной точностью из-за относительной неспецифичности определяемых ферментов, так как они присутствуют и в других органах. Целью изобретения является повышение точности способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики острой стадии вирусного гепатита путем исследования ферментативной активности сыворотки крови, определя ют активность фермента L, -треонин- Ц-серин-дегидротазы и при ее наличии диагностируют острую стадию вирусного гепатита. Способ осуществляют следующим образом. В пробирку с гепарином, калий фосфатным буфером и пиридоксальфосфатом берут кровь из вены и центрифугируют. Супернатант 0,51 мл переносят в опытную инкубационную среду L-треонин 0,3 М или L-серин, 1 1,5 мл 0,1 М трисбуфер, КС пирндоксальфосфат 0,1 мМ.Реакцию останавливают подкислением среды H.j504. (О,1 мл). Затем инкубационные пробир ки переносят в кипяР1ую водяную баню. После денатурации белка пробирки охлаждают и центрифугируют. В супернатант (2 - 1,5 мл) добавляют К-фосфат ный буфер (3,5-3,0). Образовавшуюся В результате реакции fii-кетомасляную кислоту определяют ферментативным методом с использованием лактатдегид рогеназы и HADHj. Пример 1. Кровь из вены больного Н. помещают в пробирку с ге парином, калий фосфатным буфером и пир1здоксальфосфатом, центрифугируют. Супернатант (надосадочную кровь) 1 м переносят в опытную инкубационную среду, содержащую 0,3 М ot-треонин или Ы-серин, трисбуфер О,1 М (рН 9,0) 15 мМ, КС1 0,3 мМ, пиридоксальфосфат в объеме 2 мл. В контрольной пробе субстрат отсутствует. Инкубация проводится 1 ч в водяной бане пр 37. Реакция останавливается подкис лением среды О,1 мл концентрированно HjSO. Затем инкубационные пробирки 1 3 переносят в кипящую водяную баню. После денатурации белка пробирки охлаждают и центрифугируют. Супернатант из опытной и контрольной проб переносят в стаканчики и добавляют 3 мл К-фосфатного буфера 0,5 М ,0. Образовавшуюся в результате d -треониндегидратазной реакции ot-кетомасляную кислоту определяют ферментативным методом, используя коммерческий препарат мьш1ечной лактодегидрогеназы. Для зтого содержимое стаканчика нейтрализуют 10 н КОН. К всему объему нейтрализованной реакционной смеси добавляют О,1 мл раствора HABHj, имеющего концентрацию 8мг/мл. Из смеси отбирают две аликвоты по 2,4 мл. К одной из них (опытной) добавляют 0,05 мл суспензии препарата лактатдегидрогеназы. Вторая аликвота после добавления 0,05 мл буфера служит в качестве контроля. Обе пробы инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Убыль HADHj определяют по уменьшению оптической плотности при 340 нм на спектрофотометре. Для расчета молярного количества израсходованного HADHj (соответствующего молярному количеству содержащейся в реакционной смеси о -кетомасляной кислоты) используют молярный коэффициент экстенции HADHj, равный 6,22 О. При расчете удельной активности L-трвониндегидратазы учитывают указанные разведения, а также содержание в определенной смеси возможных субстратов лактатдегидрогеназы, вероятно присутствующих в сыворотке крови, для чего проводили контрольный опыт каждой сыворотки без субстрата 1,-треонина. Относительная ошибка определения составляет 5%. Удельную активность фермента выражают как количество единиц (Н моль/ч) сыворотки. Расчёт а}стивности. Удельная активность разведение время-6,22 -10 -объем сыворотки где лТ) - разность экстенции опытной и контрольной (без субстрата) пробирок, определяемая на спектрофотометре. Пример . Расчет удельной активности исследуемого фермента при острой стадии вирусного гепатита.

uD 0,300 - 0,100 0,200,

5-3 разведение у- 7,5,

инкубация 1ч,

6,22-10 - коэффициент экстенции

HADH,

объём сыворотки 1 мл,

удельная активность /

Результаты испытаний поззоляют утверждать, что способ диагностики острой стадии вирусного гепатита с помощью предлагаемого фермента по сравнению с прототипомявляется более точным, поскольку появление фермента в сыворотке крови говорит о поражении только ткани печени, а не еще какого-либо другого органа, свойственного другим ферментным тестам