СПОСОБ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ПАЦИЕНТА Российский патент 1997 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине и может найти применение при экспресс-диагностике населения и при оценке состояния больных гепатитами.

Печень жизненно важный многофункциональный орган. О состоянии этого органа судят по многим показателям, каждый из которых обычно позволяет оценить лишь одну из функций печени. Так, известен способ оценки состояния печени, включающий определение билирубина в сыворотке крови пациента (см. Блюгер А. Ф. Новицкий И.Н. Практическая гепатология. Рига: Звайзне, 1984, с. 7 16, 406).

Однако данный показатель свидетельствует лишь о синдроме желтухи.

Известен способ оценки состояния печени, включающий определение содержания аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови пациента (см. Богомолов Б. П. Дубовицкая Н. М. Оценка диагностического значения гепатоцеллюлярных и экскреторных ферментов при вирусном гепатите А и В. Всесоюзная конференция по клинической биохимии, иммунологии и морфологии инфекционных болезней. Рига, с. 278 280).

При достаточной информативности данного показателя он не позволяет оценить состояние печени в полном объеме.

Известен способ оценки состояния печени, включающий определение содержания аланинаминотрансферазы в сыворотке крови пациента (см. Подымова С. Д. Болезни печени. М. Медицина, 1984, с. 75 77).

Данный показатель пополняет перечень показателей, характеризующих состояние отдельных функций печени, но также не дает полной информации обо всех ее функциях.

Известен способ оценки состояния печени, включающий определение протромбинового индекса в сыворотки крови пациента (см. Жданов В. М. Ананов В. А. Стаханова В. М. Вирусные гепатиты. М. Медицина, 1986, с. 143 146).

Однако ни один из известных биохимических показателей не оценивает одну из важнейших функций печени состояние метионинового обмена.

Техническим результатом, достигаемым при реализации изобретения является оценка состояния одной из функций печени метионинового обмена с использованием результатов определения нового биохимического показателя.

Достигается это тем, что в способе оценки состояния печени пациента, включающем определение биохимического показателя, в качестве показателя используют содержание L-гомосерина в моче пациента и при его содержании выше 8 мкмоль на 1 л (мкмоль/л) состояние оценивают как нарушение, причем тем более выраженное, чем выше данный показатель.

L-гомосерин-аминокислота, которая не входит в состав белков животных и человека. У растений и микроорганизмов она является промежуточным продуктом, образующимся при биосинтезе аминокислот треонина, изолейцина и метионина (см. Cohen G. N. and Saint-Girons I. "E.coli and Salmonella tiphimurium Mol. Biol." 1987, vol. 1, p. 429 444). Что касается наличия свободного гомосерина в организме млекопитающих, то в ранних сообщениях предполагалось, что он должен возникать в процессе расщепления углеродного скелета метионина (см. А. Ленинджер. Биохимия. Изд-во "Мир". М. 1974, с. 523). Однако в данных о его качественном содержании в различных тканях млекопитающих ни в технической, ни в практической литературе не обнаружено. В более поздних источниках наличие гомосерина в качестве промежуточного продукта распада метионина игнорируется (см. Finkelstein J.D. and Martin J.J. The Jounal of Biological Chemistry, 1986, vol. 261, N 4, p. 1582 1587) и считается, что углеродный скелет метионина полностью утилизируется.

Изобретением впервые установлено, что в моче людей со здоровой печенью содержится 2,5 8,0 мкмоль/л L-гомосерина. Обнаружение в моче пациента более, чем 8 мкмоль/л L-гомосерина свидетельствует о нарушении метионинового обмена в печени. Чем более выражены данные нарушения, тем выше оказывается данный показатель.

Пример 1. В основе использованного способа определения L-гомосерина в моче лежит специфический перенос фосфатной группы с аденозилтрифосфорной кислоты (АТФ) на L-гомосерин, осуществляемый ферментом гомосерин-киназой. В результате этой ферментативной реакции образуется гомосеринфосфат, который может быть идентифицирован и выделен, например, хроматографией на бумаге. Количественный перевод гомосерина в гомосеринфосфат с помощью фермента гомосерин-киназы и с использованием γ³³ P АТФ в качестве второго субстрата позволяет получить меченый ³³P гомосеринфосфат, количество которого может быть определено после хроматографического выделения радиометрически.

Для определения гомосерина в моче 0,1 мл мочи в пробирке для центрифуги Eppendorf инкубировали 5 мин при 100^oC. После этого пробирку охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали на центрифуге Eppendorf 10 мин при 14000 об. /мин для определения гомосерина использовали полученный супернатант. В стандартной процедуре определения гомосерина 5 мкл супернатанта добавляли к 15 мкл смеси, содержащей 250 mM Трис -Hcl pH 7,2; 500 mM Kcl; 20 mM MgSO₄; 20 μM ФТФ и 1 μCl γ³³ P АТФ. После этого к смеси добавляли 5 нг (10^-9 г) электрофоретически гомогенного препарата гомосерин-киназы E.coli и инкубировали 60 мин при 37^oC. Реакцию останавливали инкубацией смеси при 100^oC в течение 3 мин. Затем к смеси добавляли холодный гомосеринфосфат до концентрации 1 mM и центрифугировали на центрифуге Eppendorf 5 мин при 14000 об./мин. Хроматографированию на хроматографической бумаге Watman N1 подвергали 1 мкл полученной смеси. В качестве элюирующей жидкости при хроматографии использовали смесь н-бутанол уксусная кислота вода в соотношении 4 1,5 1,5. После хроматографирования, высушенную хроматограмму окрашивали нингидрином. Пятно соответствующее гомосеринфосфату, вырезали и просчитывали радиоактивность на счетчике Mark II в толуольном сцинтилляторе. Количество гомосерина определяли по кривой зависимости включения ³³P в гомосеринфосфат от концентрации гомосерина, построенной с помощью стандартных растворов гомосерина.

Пример 2. В моче 28 больных вирусным гепатитом определяем содержание L-гомосерина. Результаты приведены в табл. 1.

Анализ приведенных в табл. 1 данных позволяет сделать следующие выводы: в моче больных острым вирусным гепатитом В в период разгара заболевания содержание L-гомосерина значительно выше, чем у больных острым вирусным гепатитом А.

Полученные данные коррелируют с известностью того, что гепатит В является наиболее тяжело протекающим вирусным гепатитом. При выписке пациентов, перенесших вирусный гепатит В, наблюдалось значительное снижение содержания L-гомосерина в моче.

Больные, содержание L-гомосерина в моче которых было выше 30 мкмоль/л, наиболее тяжело переносили заболевание. Течение заболевания было затяжным и требовало более интенсивной терапии по сравнению с больными, содержание L-гомосерина в моче которых было ниже 30 мкмоль/л.

В моче исследованных 5 больных острым гепатитом А даже в период разгара заболевания содержание L-гомосерина не превышало 14 мкмоль/л, что, тем не менее, выше, чем содержание L-гомосерина в моче 10 обследованных добровольцев (2,5 8 мкмоль/л).

Более высоким, чем в моче здоровых добровольцев, определено содержание L-гомосерина и в моче хронических больных гепатитом С и составляло 10 20 мкмоль/л.

Пример 3. Провели сопоставление известных биохимических показателей с показателем согласно изобретению. Результаты приведены в табл. 2 и свидетельствуют о наличии корреляции между определяемыми показателями.

Новый показатель определяется просто. Анализ мочи по определению содержания в ней L-гомосерина может быть поставлен на поток и давать экспресс-информацию о состоянии печени пациентов как при их профилактических осмотрах, так и при лечении гепатитов.

Использование: в медицине. Сущность изобретения: в моче пациентов определяют содержание L-гомосерина. При содержании до 8 мкМ/л состояние печени оценивают как нормальное, а при более высоком данном показателе - как нарушенное. Показатель коррелирует с другими известными биохимическими показателями, характеризующими состояние печени пациента. Анализ прост в исполнении и может быть поставлен на поток при профилактическом осмотре населения и при контроле состояния больных гепатитами. 1 з. п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ оценки состояния печени пациента, включающий биохимическое исследование биологической жидкости, отличающийся тем, что в моче определяют содержание L-гомосерина и при его уровне выше 8 мкМ/л выявляют нарушение метионинового обмена в печени. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявляют тем более выраженное нарушение, чем выше содержание L-гомосерина в моче.