СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОФАГА ШИГЕЛЛ ЗОННЕ Советский патент 1995 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения лечебных бактериофагов.

Известен способ культивирования бактериофага шигелл Зонне путем выращивания бактерий и фага в питательной среде с последующим выделением целевого продукта.

Однако в известном способе штаммы в S-форме быстро диссоциируют с образованием SO-OR-R-форм, что не обеспечивает высокой литической активности фага в отношении вирулентных штаммов гомологичного вида.

Целью изобретения является повышение литической активности вирулентных штаммов гомологичного вида при сохранении литических свойств фага в отношении диссоциированных форм бактерий.

Эта цель достигается тем, что в способе получения бактериофага шигелл Зонне путем выращивания бактерии и фага в питательной среде с последующим выделением целевого продукта выращивание осуществляют в питательной среде в присутствии 10-12% панкреатического или 15-17% кислотного гемагидролизата.

П р и м е р. Для приготовления питательной среды используют водный раствор солей, содержащий 0,05% Na₂HPO₄, 0,05% КН₂РО₄, 0,1-0,2% глюкозы, 10-12% панкреатического или 15-17% кислотного гемагидролизата. Конечная концентрация аминного азота 0,05-0,07% пентонов 0,3-0,4% ионов железа 0,01-0,02 мг/л, рН среды 7,2-7,6, стерилизуют при 115^оС в течение 30 мин.

Для создания плотного варианта вводят 0,4-1,5% агар-агара, содержание аминного азота 0,1-0,2%
Панкреатический гемагидролизат получают путем гидролиза сухим панкреатином (8-10% ) отходов производства гамма-глобулина. Избыток ионов железа удаляют добавлением 1-3% активированного угля.

Кислотный гемагидролизат получают в результате гидролиза того же сырья соляной кислотой при 127^оС. Избыток ионов железа удаляют дробным осаждением при изменении рН.

На данных средах было испытано 20 штаммов шигелл Зонне в Svir-форме и бактериофаг S-1 гомологического вида.

Культивирование бактерий шигелл Зонне проводят на 1,5%-ной агаровой среде, фага в жидкой среде при 37^оС.

В питательную среду добавляют смыв 18-часовой агаровой культуры штамма-субстрата до конечной концентрации 5-8˙10⁷ бактериальных клеток в 1 мл, инкубируют в статических условиях гетерогенного поверхностного культивирования в течение 1-1,5 ч. Затем определяют концентрацию микробных клеток по оптическому стандарту мутности и заражают фагом с множественностью заражения 1/1-2 или 1/100-150 (соответственно 1 фаговая частица на 1-2 бактериальные клетки 1 цикл, и 1 фаговая частица на 150-100 бактериальных клеток 2 цикла).

Данные о диапазоне и степени литической активности клона S-1 приведены в таблице.

Из таблицы видно, что клон S-1, полученный предложенным способом с использованием штамма-субстрата Svir-хемотипа на среде с основой роста в виде панкреатического или кислотного гемагидролизата обладает одинаково широким диапазоном и высокой степенью литической активности как в отношении диссоциированных форм (хемотипы Ra, Rb, Rс, Rd) lg xg 4,9±0,39, так и в отношении вирулентных для человека штаммов lgxg 5±0,39). Различия статистически не значимы (Р > 0,05).

Клон S-1, полученный известным способом на диссоциированных вариантах Sh. Sonnei N 28 хемотипов Ra и Rb, Rc, Rd (SO-OR-R-формы) на бульонах Хоттингера и Мартена, обладает более узким диапазоном и низкой степенью литической активности в отношении вирулентных штаммов шигелл Зонне. Логарифм средней геометрической титра по Аппельману на Svir-штаммах составляет 1,47±0,6 (штамм-субстрат Ra-хемотипа) и 0,27±0,2 (штамм-субстрат Rb, Rc, Rd-хемотипов). Диссоциированные штаммы, клон S-1, выращенные известным способом на бактериальных клетках Ra-Rd-хемотипов, лизировали в достоверно более высоком титре -lgxg 4,27±0,56 и 3,2 ±0,48 (Р < 0,01).

Найденные различия в широте диапазона и степени литической активности клона S-1, полученного известным (прототип) и предложенным способами, статистически значимы (Р < 0,01).

Снижение степени и сужение диапазона литической активности клона S-1 в отношении вирулентных для человека штаммов Зонне носит необратимый характер, т.е. при возврате его (S-1) на культуру Svir-хемотипа свойства не восстанавливаются. Культивирование штаммов Зонне на этих средах позволяет сохранить в Svir-форме 94% (на кислотном гемагидролизате) и 100% штаммов (на панкреатическом). Среднее количество колоний S-формы при рассеве на 1,5%-ную агаровую среду составляет 97,5± ±1,5% и 98,2±0,7% в зависимости от используемой основы. Конечный титр бактериофага 5,7-7,2˙10⁹.

Штаммы шигелл Зонне могут длительно храниться без изменения антигенных свойств.

Использование способа позволяет расширить диапазон литической активности бактериофагов Зонне в отношении вирулентных для человека штаммов и тем самым повысить эффективность компонента Зонне поливалентного дизентерийного бактериофага, лизирующего как вирулентные формы бактерий при активном инфекционном процессе, так и диссоциированные и непатогенные формы, выделяемые реконвалесцентами, ускоряя санацию последних и способствуя снижению заболеваемости.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОФАГА ШИГЕЛЛ ЗОННЕ путем выращивания бактерий и фага в питательной среде с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения литической активности фага в отношении вирулентных штаммов гомологичного вида при сохранении литических свойств в отношении диссоциированных форм бактерий, выращивание осуществляют в питательной среде в присутствии 10 12% панкреатического или 15 17% кислотного гемагидролизата.