ШТАММ БАКТЕРИОФАГА BACTERIOPHAGUM SALMONELLA IBP-1, ОБЛАДАЮЩИЙ ЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К S.ENTERITIDIS Российский патент 2008 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной медицине, а именно к созданию биологических препаратов для профилактики и лечения сальмонеллеза, а также может быть использовано для борьбы с носительством возбудителей сальмонеллезных инфекций у птицы, что является необходимым условием при производстве экологически чистых продуктов питания человека.

В настоящее время известны различные штаммы бактериофагов Bacteriophagum salmonellae, используемые для получения препаратов для лечения и специфической профилактики сальмонеллеза кур (1, 2).

Однако эти штаммы выделены в основном из животноводческих хозяйств (крупный и мелкий рогатый скот, свиньи) и поэтому препараты, изготовленные на основе этих штаммов, приходится применять в достаточно высоких дозах, в несколько десятков раз превышающих ту дозу, которую мы рекомендуем в изготовленном нами препарате на основе данного штамма, выделенного из птицеводческого хозяйства.

Известен также бактериофаг, применяющийся в хозяйствах, неблагополучных по пуллорозу - тифу птиц, вызываемому Salmonella gallinarum-pullorum (3).

Фаг обладает хорошим профилактическим и лечебным эффектом, но слишком трудоемок и для проведения оздоровительных мероприятий в больших птицеводческих хозяйствах требует значительных материальных затрат, т.к. для профилактики препарат дают цыплятам и индюшатам с первого дня жизни ежедневно в течение десяти дней раз в день по 0,5-1,0 мл, а с лечебной целью два раза - утром и вечером по 1-2 мл до полного выздоровления.

Прототипом заявляемого изобретения является препарат, изготовленный из нескольких штаммов, таких как: штамм бактериофага Bacteriophagum salmonellae и штамм Phagum Salmonella choleraesuis CS1-ДЕП, Phagum Salmonella choleraesuis CS2-АЕП, обладающие противосальмонеллезной активностью и устойчивостью к бактериостатикам (4).

Его применяли аэрозольно в выводных шкафах инкубатория. Распыляли во время вывода цыплят однократно в дозе 5 мл/м³. Аэрозоли бактериофага в птичниках применяли в присутствии птицы через день в течение первых 10 дней выращивания цыплят в дозе 0,25 мл/м³ + per os с кормом ежедневно в течение первых десяти дней содержания в дозе 0,3 мл/гол. Эта схема оздоровления хозяйства не только достаточно трудоемка, но и слишком велико количество балластных штаммов бактериофагов.

Как известно, острой проблемой современной медицины и ветеринарии в настоящее время является широкое распространение мультирезистентных бактериальных штаммов, резко изменивших этиологическую структуру кишечных инфекций и увеличивших роль условно-патогенных бактерий.

В связи с уменьшением эффективности действия антибиотиков, аллергической реакции организма на их введение и появление полирезистентных штаммов бактерий актуальным становится поиск и применение новых, высокоактивных, безвредных антибактериальных препаратов, к которым и относятся лечебно-профилактические бактериофаги.

Задачей, решаемой в рамках данного изобретения, является получение штамма бактериофага Bacteriophagum salmonellae с широким спектром литического действия.

Указанная задача решается получением штамма бактериофага Bacteriophagum salmonellae IBP-1, обладающего лизирующей активностью по отношению к S.enteritidis.

Штамм бактериофага Bacteriophagum Salmonellae IBP-1, выделенный из сточных вод гусеводческого хозяйства, депонирован в коллекции бактериофагов кафедры эпидемиологии ГОУ ВПО Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова (СПбГМА им. И.И.Мечникова) под №0048.

Бактериофаг характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки:

Посредством электронного микроскопа установили морфологию и размеры фаговых частиц. Головка гексагональной формы размером 80×80 нм, длина хвостового отростка в сокращенном состоянии - 104,24 нм, в растянутом - 120,23 нм

На газоне чувствительных бактериальных культур S.enteritidis фаг IBP-1 образует прозрачные пятна лизиса диаметром 1.5-2.0 мм с ореолом. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.

Серологические характеристики.

Фаг не инактивируется антисыворотками, полученными к другим бактериальным вирусам Salmonella spp. из коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (10 различных форм). Константа инактивации фага гомологической антисывороткой (К) составляет 85 мин^-1. Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.

Физико-химические свойства фага:

Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 40 мин при 55°С. Пределы допустимых значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 5-11. Устойчив к хлороформу.

Литический спектр бактериального вируса.

Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция S.enteritidis из 150 штаммов. Фаг обладает способностью лизировать 47% культур штамма S.enteritidis.

Диапазон специфичности: лизирует S.enteritidis, не лизирует дизентерийные палочки (шигеллы Зонне, Флекснера), свежевыделенные и музейные штаммы кишечной палочки, синегнойной палочки и штаммы других представителей нормальной микрофлоры. Бактериальные штаммы для поддержания и размножения бактериофага S.enteritidis. Штаммы SVZ-3 и SVZ-5, депонированные в коллекции ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии.

Оптимальные условия размножения:

Условия культивирования. Штамм фага размножается на чувствительной культуре сальмонеллы SVZ-5 на обычных питательных средах (пептонная вода, мясо-пептонный питательный агар) при температуре 37°С, вызывая при этом просветление пептонной воды после 6-часовой инкубации, а на простом питательном агаре образуя прозрачные колонии правильной формы после 16-18-часовой инкубации. Титр активности штамма бактериофага проверялся методом Аппельмана. Титр штамма бактериофага, то есть максимальное разведение, при котором определяется литическое действие фага при тестировании методом Аппельмана, составил 10⁹ при тестировании методом агаровых слоев по Грациа - 1,7-2×10⁹.

Условия хранения: бактериофаг IBP-1 сохраняет литические свойства при хранении при температуре 4-6°С в пептонной воде в течение 1 года. Периодичность пересевов - 1 год. Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 45-50 мин, урожайность - 75-80 частиц на одну клетку.

Способ получения бактериофага.

Штамм бактериофага был получен из сточных вод гусеводческого хозяйства. Материал был засеян в пептонную воду вместе с двумя различными штаммами S.enteritidis SVZ-3 и SVZ-5, обладающими высокой чувствительностью к фагам. После 18-часовой инкубации в термостате при температуре 37°С фаголизат профильтрован через мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм.

Проверка литической активности производилась путем нанесения капель фильтрата фаголизата на использованные в процессе инкубации штаммы сальмонеллы, посеянные "газоном" на мясо-пептонном питательном агаре. Учет результатов производился после 18-20-часовой инкубации чашек при температуре 37°С. На месте капель фаголизата на обоих штаммах S.enteritidis отмечались стерильные пятна диаметром, равным размеру нанесенной капли (10-11 мм), свидетельствовавшие о лизисе бактериальных клеток.

В дальнейшем проводилось повышение титра литической активности путем последовательных пассажей штамма бактериофага на высокочувствительной культуре S.enteritidis SVZ-5 в бульоне. После инкубации штамма сальмонеллы в пептонной воде до середины логарифмической фазы роста добавлялся штамм бактериофага из расчета 1:30, смесь инкубировалась при температуре 37°С в течение 16-18 ч.

Активность полученного фаголизата проверялась на простом питательном агаре на данном штамме сальмонеллы после предварительного фильтрования. Последовательные пассажи фага (7 пассажей) проводились до получения стерильных пятен без образования колоний вторичного роста.

Фаговую суспензию разводили десятикратным разведением до уровня 10^-1.Из каждой пробирки брали пробу по 1,0 мл фаговой суспензии и добавляли смыв 18-часовой агаровой культуры в объеме 0,1 мл. К этой смеси добавляли расплавленный до 46°С 0,7% агар-агар на питательном бульоне, содержимое пробирки выливали на предварительно приготовленные чашки Петри с твердым слоем 1,5% агар-агара на питательном бульоне. Чашки оставляли до застывания верхнего слоя. Затем их переворачивали дном вверх и в таком положении инкубировали в термостате при 37°С 18 ч. На следующий день становится возможным подсчет стерильных пятен в виде прозрачных зон на непрозрачном фоне бактериального роста.

Фаг IBP-1 обладает широким спектром литического действия на бактерии Salmonella enteritidis и может быть использован для изготовления лечебного препарата бактериофага.

Источники информации

1. RU №2035510 C1, 20.05.1995.

2. RU №2026082 С1, 01.09.1995.

3. П.П.Достоевский, П.Ф.Корниенко, Д.М.Вовк. «Справочник ветеринарных препаратов», Киев, «Урожай», 1986.

4. RU №95101400, A1, 11.27.1996.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в создании биологических препаратов для профилактики и лечения сальмонеллеза. Штамм бактериофага Bacteriophogum Salmonella IBP-1, обладающий лизирующей активностью по отношению к S. Enteritidis, может быть использован для изготовления лечебного препарата бактериофага. Изобретение позволяет расширить спектр литического действия на бактерии Salmonella enteritidis.

Штамм бактериофага Bacteriophagum salmonella IBP-1, обладающий лизирующей активностью по отношению к S.enteritidis.