Способ определения метаболитов в биологическом материале Советский патент 1985 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в медицине для определения содержания метаболитов в биопсийном материале тканей при оперативных вмешательствах, а такЛе в условиях эксперимента на животных для характеристики специфики обмена каждой ткани в норме в качестве диагностических и прогностических тестов при патологических состояниях

Цель изобретения - дополнительное определение, в одной прЬбе малата, лактата, с -глицерофосфата, (f -оксибутирата, глутамата, оксалоацетата, ацетоацетата и диоксиацетонфосфата,

Пример. Биопсийный материал (например, печень) после взятия зал7ивают жидким азотом, навеску в 200мг гомогенизируют до получения однородной порошкообразной массы, подливая жидкий азот. Порошок заливают 0,4мл 0,6 н. paicTBOpa НСЮ., тщательно растирают при комнатной температуре и оставляют для экстракции на 20 мин. По истечении времени центрифугируют при 600 д 15 мин. Кислый супернатант сливают, осадок денатуризованного бека отбрасывают. По универсальному индикатору нейтрализуют 2 н. КОИ 0,6 мл. Помещают в ледяную баню на 5 мин и центрифугируют при 600 д 5 №1Н для освобождения от гипохлорида калия.

Определение содержания малата, лактата, oL-глицерофосфата,глутДмата и -оксибутирата.

Состав реакционной смеси:

Буфер глицин гидразинсу,пьфатный,

рН 9,5,глицин 0,5 М,

гидразин-сульфат

0,4 М, 1-ш2,8

НАД 0,9 мг/мл, мл0,1

Нейтралязованньй

экстракт, мл0,1

Фермент, MKI 0

Общий объем смеси 3 мл.

Длина волны 340 нм, слепой опыт не содержит кофермента. Реакция начинается- последовательным внесением фермента малатдегидрогеназы, лактатдёгиедзогеназы,о -глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, и JP оксибутиратдегидрогеназы. Учитывается прирост оптической плотности с момента внесения соответствующего фермента до прекращения прироста и стабилизации показателей: Е - ЕО сответствует содержанию малата в пробе; J-EO лактата; Е,-EoV -глицерофосфаа; ЕО - глутамата; Eg-Eg PI -оксибутирата. Концентрация метабоетов выражается в микромолях на 1 г кани. Расчет ведут по формуле

С - АЕ.З 6,22.К

де ДЕ - разница между конечной и начальной oптичecки и плотностями;

К - коэффициент разведения; 3 - объем реакционной смеси; 6,22 - коэффициент микромолярной

экстинции НАД. Н при 340 нм 1 см /мкмоль) .

Приведенная формула является одотипной дпя расчета содержания опеделяемых метаболитов и коферментов микромолях на 1 г ткани. Определение малата. Вносят малатдегидрогеназу ЕО0,067

0,100

EI0,102

,035

С 0,545

Определение лактата. Вносят лактатдегидрогеназу ЕО0,115

0,145 0,170 0,195 0,260 0,300 0,320 . 0,340 0,370 0.415

,415

,300

С 4,38.

Определение cL -глицерофосфата. Вносят i:/- -глицерофосфатдегидроеназу

ЕО0,320

0,340 0,352 0,370 0,375 0,382 0,385 6,385

Ei

ДЕ0,065

С 1,013 Определение глутамата. Вносят глутаматдегидрогеназу ЕО0,395

0.415 0,475 ,475 4Е 0,080 С 1,25 Определение Э оксибутирата. Вносят р -окси6утиратдегидрогена 0,485 0,500 0,510 0,525 0,540 0,550 0,555 0,560 0,560 0,065 С .1,013 Определение пирувата, оксалоацет та, с -кетоглутарата, . диоксиацетонфосфата и ацетоацетата. Состав реакционной смеси: Буфер триэтаноламин солянокислый 0,1М, рН 7,5, мл2,7 НАДИ 3 мг/мл, мл0,1 Нейтрализованный : экстракт, мл0,2 Фермент, мкг10 Общий объем смеси 3 мл. Определение ведется при длине вол ны 340 нм, слепой опыт не содержит кофермента. Реакцию начинают внесением фермента для определения пирув та лактатдегидрогеназы. Регистрируе ся Е . Реакция учитывается до стаби лизации показателя оптической плотности в течение 3-5 мин, (Е ). Посл довательным внесением малатдегидрогенаэы, глутаматдегидрогеназы,°С -гл церофосфатдегидрогеназы и -оксибу тиратдегидрогеназы регистрируется уменьшение оптической ппотности (Ej Ej, Е. и Е) ДЕ соответствует соде жанию в пробе оксалоацетата,оС-кето глутарата, диоксиацетонфосфата,ацето ацетата. Определение пирувата. Вносят лактатдегидрогеназу ЕО0,740 Е0,712 ,028 С 0,409. Определение оксалоацетата. Вносят малатдегидрогеназу ЕО0,715 Ег0,690 ,025 С ,366 Определение ct -кетоглутарата. Вносят глутаматдегидрогеназу ЕО0,695 Ej0,645 ,040 С « 0,586 Определение диоксиацетонфосфата. Вносят с глниеоофосфатдегидроазуEf0,625 ,020 С 0,293 Определение ацетоацетата, Вносят оксибутиратдегидрогеназу Г0,630 S0,617 0,013 « 0,184.

) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРШЛЕ путем фиксации ткани, осаждения белка хлорной кислотой и спектрофотометрирования при 340 им в присутствии никотинамидного кофермекта и ферментов лактатдетидрогеназы.при определении пирувата и глутаматдегидрогеназы при определении dl-кётоглутарата, о т л и ч а ю щи и с я тем, что ,с цёI лью дополнительного определения в одной пробе малата, лактата, -глицерофосфата, -оксибутирата, глутамата, оксалоацетата, ацетоацетата, н диоксиацетонфосфата, вносят часть I нейтрализованного экстракта в глицингидразиновый буфер рН 9,5, содержащий 4, К окисленный никотинамид адениндинуклеотид и определяет малат, лактат, -глицерофосфат,глутамат и -оксибутират при последовательном добавлении соответственно малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, dl тлицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и 0-оксибутиратдегидрогеназы, а другую часть нейтрализованного экстракта вносят в триэтаноламинсолянокислый буфер рН 7,6, содержащий 1, М восста(П новленный никoтинa шдaдeниндинyклeoТ ед, и определяют пируват, оксалоацетат, d- -кетоглутарат, диоксиацетонфосфат и ацетоацетат при последовательном добавлении соответственно лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, глутакатдегидрогеназы, с --глиСП церофосфатдегидрогеназы и } -окси бутиратдегидрогеназы. NU ел со