Способ получения плазминогена Советский патент 1985 года по МПК A61K38/48 

Изобретение относится к медицин кой промьшшенносги и касается техн логии получения ферментных препара тов. Цель изобретения - упрощение сп соба. Способ поясняется следующими примерами. Пример 1. К5л жидкости, являющейся отходом после выделения церулоплазмина, прибавляют сухой Nad до концентрации 0,14 М, доводят рН жидкости до 7,4 с помощью 0,5 М фосфатного буфера с рН 7,4. Далее выделение плазминогена ведут на a44iKHHOM сорбенте. Добавляют 60 г Ь-лизин сополимера малеинового ангидргща с N-винилпирролидоном, тщательно перемешивают в течение 14 ч при (-4) -(-7) для сорбции плазминогена. Затем прекращают перемешивание. После отстаивания суспензии в течение 30 мин надосадочную жидкость декантируют и удаляют. Проводят неспецифичёскую элюцию балластных белков 3-4-кратным объемом 0,5 М раствора NaCl S 0,01 К фосфатном буфере, рН 7,4 при +18-25 0. Эту операцию повторяют несколько раз до тех пор, пока (j промывных вод становится ниже 0,1. Затем осуп1ествляют специфическую злюцию плазминогена; асМшнный сорбент с сорбированным . Ш1азмзп1огеном наносят на воронку Бюхнера, прибавляют 2 3-кратное количество охлажденного до элю та 0,2 М раствора -аминокапроново кислоты в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,3,перемешивают в течение 3-4 мин жидкость отсасывают с помощью водо струйного насоса. Операцию повторя до тех пор, пока Е28о получаемого элюата становится не выше 0,150. Объем элюата 1-1,5 л. Полученньй элюат,содержащий плазминоген,подвер гают обессоливанию путем гель-филь рации на колонках из молсёлекта G-25, которые предварительно эквил рируют дистиллированнойводой,подкис ленной уксусной кислотой до рИ 4,0 (параметры колонки: внутренний диа метр 8 см; высота 50 см; объем 2,0 После гель-фильтрации раствор плаз ногена, освобожденный от солей и ;-аминокапроновой кислоты, подвергаю лиофильному высушиванию в следу сще режиме: замораживание проводят при -50°С, высушивание в сублимационной камере ТГ-15 в течение при подогреве не выше . Режим лиофилизации соответствует требованиям Типового регламента производства губки гемостатической, 1972 г. Выход плазминогена - 904 мг. П р и М е р 2. Способ получения плазминогена до этапа лиофилизации проводят согласно схеме, указанной в примере 1. Раствор плазминогена после гель-фильтрации подвергают лиофильной сушке в следующем режиме: замораживание проводят при -40 С, высушивание - в сублимационной камере ТГ-15 в течение 45 ч при подогреве не более 38 С. Режим лиофилизации соответствует требованиям Регламента производства фибринолизина, 1978 г. Выход плазминогена - 1102 мг. П р и М е р 3. Способ получения плазминогена до этапа лиофилизации проводят согласно схеме, указанной в примере 1. Раствор плазминогена после гель-фильтрации лиофильно высушивают в следующем режиме: замораживание проводят при -40 С, высушивание - в сублимационной камере ТГ-15 в течение 18 ч при подогреве не более 22 С. Режим лиофилизации соответствует требованиям Регламента производства иммуноглобулина человека нормального, №131-79. Выход - 808 мг. Содержание белка в препаратах плазминогена определяли спектрофото- метрически в 1 см кювете, принимая, что Е 2.SC) 1%-ного раствора плазминогена 17 или 16 для растворов белка в кислой среде. Потенциальную активность плазминогена в лиофилизированных препаратах определяли, используя в качестве субстрата 1%-ный раствор казеина; в качестве активатора плазминогена использовали раствор стрептокиназы (препарат Streptase фирмы Behringwerke Ag), содержащий 750000 Е/фл. За 1 казеинолитическую единицу принимали такое количество фермента (плазмина, образовавшегося из плазминогена), которое освобождает 450 мкМ растворимого в 15%-ной трихлоруксусной кислоте тирозина в условиях анализа.. Влагу в препаратах плазминогена определяли при 105°С (см. Регламент производства фибролизина, 1978 г). SDS-электрофорез лиофилизированных препаратов плазминогена проводили 3 в полиакриламидном теле в системе трис-бортаного буфера при рН 7,4. 11878264 На анализ брали растворы плазминогена. содержащие 25-50 у белка.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМИНОГЕНА, включающий дбработку животного сырья хлоридом натрия в фосфатном буфере, аффинную хроматографию, элюцию хлоридом натрия в фосфатном буфере, затем аминокапроновой кислотой с последующим вьщелениём целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве сырья используют отходы получения церулоплазмина, а полученный элюат подвергают гель-фильтрации на молселекте и лиофилизируют.