СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ ИЗ ОРГАНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 1996 года по МПК A61K35/39 A61K35/42 A61K35/55 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения основного ингибитора протеиназ (типа Кунитца) из органов крупного рогатого скота, и может быть использовано в медицинской промышленности для приготовления лекарственных препаратов, используемых для лечения заболеваний, связанных с дисбалансом систем протеолиза организма.

Известен способ получения основного ингибитора протеиназ из животного сырья путем экстракции, фильтрования, термической обработки, многократного высаливания и лиофильной сушки. Однако он технологически сложен, а активность выделяемого препарата мала.

Ближайшим техническим решением является способ получения ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота, который заключается в том, что сырье измельчают, проводят экстракцию в кислой среде, обрабатывают экстракт, после удаления осадка целевой продукт выделяют из экстракта хроматографией на адсорбенте силикатного типа и осаждают из элюата органическими растворителями.

По указанному способу удается выделить продукт с активностью 500-1500 КИЕ/мг, не отвечающий требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам ингибитора протеиназ. Для приготовления лекарственных форм основного ингибитора протеиназ. Для приготовления лекарственных форм основного ингибитора протеиназ требуется его дополнительная очистка.

Ожидаемый технический результат от предлагаемого способа состоит в увеличении удельной активности и чистоты выделяемого препарата основного ингибитора протеиназ, что необходимо для его медицинского применения.

Предлагаемый способ получения основного ингибитора протеиназ заключается в том, что органы крупного рогатого скота, содержащие ингибитор (легкие, поджелудочная железа, слюнные железы), измельчают, экстрагируют в кислой среде, отделяют жмых, обрабатывают экстракт для удаления липидов и белков, основной ингибитор протеиназ хроматографируют на сульфокатионите, из элюата с ионита после обработки соляной кислотой до рН 1 3 удаляют балластные белки, супернатант обрабатывают трихлоруксусной кислотой до ее концентрации 2,5 7,0% удаляют примесные белки, высаливают основной ингибитор протеиназ, отделяют высокомолекулярные белки и пигменты хроматографией, а затем выделяют препарат осаждением ацетоном или лиофильной сушкой.

Получают апирогенный препарат, активность которого не менее 5000 КИЕ/мг. По данный электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле (рН 4,5) препарат гомогенен по белковому составу (Rf 0,74). Дополнительная оценка качества продукта с помощью аминокислотного анализа и высокоэффективной жидкостной хроматографии показала его идентичность основному ингибитору протеиназ Кунитца (апротинин ("Novo", Дания)).

Отличительными признаками предлагаемого способа является ионообменная хроматография на сульфокатионите, обработка элюата соляной кислотой до рН 1
3, отделение осадка, обработка супернатанта трихлоруксусной кислотой до ее концентрации 2,5 7,0% удаление примесных белков, высаливание основного ингибитора протеиназ, отделение высокомолекулярных белков и пигментов хроматографией и лиофильная сушка препарата.

П р и м е р 1. Один кг замороженной поджелудочной железы крупного рогатого скота измельчают на мясорубке. Проводят экстракцию железы 65% водным раствором этилового спирта при значении рН 3,0, которое поддерживают с помощью фосфорной кислоты. После отделения жмыха экстракт подвергают вакуумной дистилляции до содержания этанола 20% и охлаждают до температуры 5^oC. Образовавшийся осадок отделяют сифонированием, а экстракт фильтруют. Прозрачный экстракт пропускают через макропористый сульфокатионит КУ-23 в Н-форме (2•20 см). По окончании сорбции катионит промывают 0,1 м раствором хлорида аммония до достижения на выходе с колонны оптической плотности при длине волны 280 нм (D₂₈₀) не более одной оптической единицы. Десорбцию основного ингибитора протеиназ с ионита проводят 1 М раствором хлорида натрия с рН 12,3. В элюате с активностью 3600 КИЕ/мл с помощью 18% раствора соляной кислоты устанавливают рН 2,0. После выдерживания в течение 12 ч выпавший осадок отделяют фильтрованием.

К супернатанту при перемешивании постепенно прибавляют 50% раствор трихлоруксусной кислоты до достижения ее концентрации 4,5% После выдерживания в течение 2 ч выпавший осадок отделяют фильтрованием, к прозрачному раствору прибавляют хлорид натрия до его концентрации 320 г/л и перемешивают до полного растворения соли. Через 12 ч осадок отделяют центрифугированием.

Осадок основного ингибитора протеиназ растворяют в 15 мл раствора 0,025 М соляной кислоты и этот раствор фильтруют через слой активированного угля. Осветленный раствор наносят на колонку с сефадексом G-50f (1,5•50 см) и ведут хроматографию в растворе 0,025 М соляной кислоты. На выходе с колонки фракции основного ингибитора протеиназ объединяют и подвергают раствор стерилизующей фильтрации. При температуре 5^oC осаждают основной ингибитор протеиназ из раствора шестью объемами ацетона, выдерживают раствор 12 ч, оделяют осадок центрифугированием и сушат при температуре 20^oC до постоянной массы. Получают 10 мг апирогенного порошка основного ингибитора протеиназ белого цвета с активностью 5000 КИЕ/мг. По данным электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле при рН 4,5 и аналитической гельхроматографии препарат не содержит примесных белков.

П р и м е р 2. Один кг замороженных легких крупного рогатого скота измельчают на мясорубке и перемешивают в течение 2 ч с раствором, приготовленным из 5,0 л дистиллированной воды и 105 мл фосфорной кислоты. Легочную ткань отделяют центрифугированием. Экстракт нагревают до 70^oC, а затем охлаждают до 25^oC. Добавляя 20% раствор гидрооксида натрия, устанавливают в растворе рН 5,6. Полученному раствору дают отстояться в течение 12 ч. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, а в растворе с помощью 20% раствора гидрооксида натрия устанавливают рН 9,5. Через 12 ч раствор фильтруют и пропускают микропористый сульфокатионит Bio-Rex 40 в Na-форме (4•40 см), уравновешенный при рН 9,5. По окончании сорбции катионит промывают фосфатным буфером с рН 10,5 до достижения на выходе с колонки D₂₈₀ не более 0,5. Десорбцию основного ингибитора протеиназ с ионита проводят 1 М раствором хлорида натрия с рН 12,3. В собранном элюате с ингибирующей активностью 1500 КИЕ/мл с помощью 18% раствора соляной кислоты устанавливают рН 3,0. Смесь выдерживают в течение 12 ч и отделяют выпавший осадок фильтрованием.

К прозрачному супернатанту прибавляют 50% раствор трихлоруксусной кислоты до достижения ее концентрации 7% Смесь выдерживают 2 ч, отделяют осадок балластных белков сифонированием и фильтрованием. К очищенному раствору прибавляют хлорид натрия до его концентрации 300 г/л. После растворения соли раствор выдерживают 12 ч, и выпавший осадок отделяют центрифугированием.

Осадок основного ингибитора протеиназ растворяют в 20 мл 0,05 М раствора аммония углекислого кислого. Проводят хроматографию на сефадексе G-50f (2,5•85 см) в растворе 0,05 М аммония углекислого кислого. На выходе с колонны фракции основного ингибитора протеиназ объединяют, и раствор стерильно фильтруют. Бесцветный раствор подвергают лиофильной сушке. Получают 100 мг белого апирогенного порошка основного ингибитора протеиназ с активностью 5200 КИЕ/мг. По поданным электрофореза в полиакриламидном геле и аналитической гель-хроматографии препарат имеет гомогенный белковый состав.

П р и м е р 3. Один кг замороженных околоушных желез крупного рогатого скота измельчают на мясорубке. Измельченную массу постепенно загружают в емкость с 5,0 л раствора серной кислоты с рН 2,0, смесь перемешивают в течение 2 ч, поддерживая значение рН 2,0. По окончании экстракции жмых отделяют фильтрованием через бязь. С помощью 20% раствора гидрооксида натрия устанавливают в экстракте рН 9,0. Через 12 ч выпавший осадок отделяют центрифугированием. 20 мл смолы КУ-23 в Na-форме, уравновешенной фосфатным буфером при рН 9,0, помещают в экстракт, смесь перемешивают 2 ч. Затем сульфокатионит осторожно отделяют от основной массы раствора и загружают в колонну (2•12 см). Смолу отмывают 0,25 М раствором хлорида натрия с рН 9,0 до достижения на выходе с колонны значения D₂₈₀ не более 0,5. Элюцию основного ингибитора протеиназ проводят 1 М раствором хлорида натрия с рН 12,3. На выходе с колонны фракции с D₂₈₀ более 1,0 объединяют.

В элюате основного ингибитора протеиназ с помощью 18% раствора соляной кислоты устанавливают рН 1,0. Смесь выдерживают 2 ч и отделяют выпавший осадок белков центрифугированием. К прозрачному супернатанту постепенно прибавляют 50% раствор трихлоруксусной кислоты до достижения ее концентрации 2,5% Смесь выдерживают 2 ч при температуре 5^oC, затем отделяют осадок балластных белков центрифугированием. К очищенному раствору прибавляют сульфат аммония из расчета на 10 мл раствора 6 г соли. Через 10 ч осадок ингибитора протеиназ отделяют wентрифугированием, раствор в 3 мл 5% раствора уксусной кислоты и наносят на колонку с гидрофильным гелем ЭД-5,0 (1,5• 50 см). Проводят хроматографию в растворе 5% уксусной кислоты.

Раствор основного ингибитора протеиназ подвергают стеpилизующей фильтрации и лиофильно сушат. Получают 3 мг белого апирогенного порошка основного ингибитора протеиназ с активностью 5000 КИЕ/мг. Дополнительная оценка качества препарата с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и аналитической гельхроматографии показала, что продукт имеет гомогенный белковый состав.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения основного ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота. Технический результат от применения изобретения состоит в увеличении удельной активности и чистоты препарата основного ингибитора протеиназ, что делает возможность его медицинское использование. Предлагаемый способ получения включает измельчение сырья, экстракцию в кислой среде, обработку экстракта, хроматографию на сульфокатионите, обработку элюата с катионита соляной кислотой до рН 1 - 3 и отделение осадка, обработку супернатанта трихлоруксусной кислотой до ее концентрации 2,5-7,0%, удаление примесных белков, высаливание целевого продукта и его очистку хроматографией, осаждение или лиофильную сушку препарата.

Способ получения основного ингибитора протеиназ из органов крупного рогатого скота путем измельчения сырья, экстракции в кислой среде, удаления осадка, хроматографии с последующей очисткой целевого продукта ацетоном и его высушиванием, отличающийся тем, что хроматографию проводят на сульфокатионите, элюат обрабатывают соляной кислотой до рН 1 3, отделяют осадок, надосадочную жидкость обрабатывают трихлоруксусной кислотой до концентрации 2,5 7,0% удаляют выпавшие белки, а из надосадочной жидкости высаливают целевой продукт, очищают хроматографией и лиофилизуют.