Способ определения содержания плазминогена в биологической жидкости Советский патент 1991 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицинской биохимии и может быть использовано в кли- нико-лабораторной практике при диагностике и лечении заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза.

Цель изобретения - ускорение способа и устранение зависимости от видовой специфичности объекта исследования.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Достоверность предложенного способа оценивают путем сравнительного определения количества плазминогена в модельной смеси.

В свободную от плазминогена плазму объемом 2 мл вносят известное количество плазминогена (см. таблицу). На колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы (концентрация иммобилизованного лизина 1-3 мМ), наносят 2 мл цитратной плазмы крови, разбавленной в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером. Белки плазмы элюируют 0,1 М натрий-фосфатным буфером до нулевого поглощения при 280 нм. Биоспецифически связанный плазминоген элюируют 0,1 М раствором Ј -аминокапроновой кислоты в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, до нулевого поглощения раствора при 280 нм. Скорость нарастания и элюции - 60 мл/ч. Концентрацию плазминогена в плазме рассчитывают по формуле

ДЕ V2 Плазминоген, мг/мл

10,

17,0 Vi

где ЛЕ Е280 - Ез20 - разница величин экс- тинкции, измеренных при 280 и 320 нм (вычитание экстинкции при 320 нм представляет собой поправку на мутность); 17,0 - коэффициент экстинкции

Л V

Е 280 для плазминогена в слабощелочной среде при длине волны 280 нм;

О 00

io ел ел

Vi - объем взятой для анализа плазмы; V2 - объем спектрофотометрируемого раствора.

В нашем случае: АЕ 0,114; Vi 2 мл;

/2 4 МЛ,

Концентрация плазминогена 0,114 -4

17 -2

10 0,135 мг/мл плазмы.

Как видно из таблицы, весь внесенный в плазму плазминоген биоспецифически связывается с аффинным сорбентом и затем полностью элюируется Ј-аминокапро- новой кислотой при соблюдении предложенных условий.

П р и м е р 2. Определение и расчет проводят так же, как в примере 1, но для определения берут 1 мл плазмы, а для элю- ирования плазминогена 0,01 М раствор Ј- аминокапроновой кислоты в 0,05 М Na-фосфатном буфере.

Vi - 1 мл; V2 3 мл; ДЕ 0,076.

Концентрация 0,076 3

плазминогена

17 1

10 0,135 мг/мл плазмы. Кроме того, содержание плазминогена определяют и в других биологических жидкостях.

Пример 3. 2 мл синовиальной жидкости больного ревматоидным артритом разводят в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером, наносят на колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы, промывают 0,1 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4. Элюиро- вание плазминогена проводят 0,1 М раствором Ј-аминокапроновой кислоты в 0,05 М натрий-фосфатном буфере, рН 7,1, затем спектрофотометрируют, как в примерах 1 и 2.

При этом ДЕ 0,062; Vi 2 мл; V2 4 мл.

Концентрация плазминогена

° 72-24 10 ° 073 МГ/МЛ

Концентрация плазминогена в синбви- альной жидкости 16 больных ревматоидным артритом (в период обострения) составила 0,0668 ±0,0079 мг/мл.

Пример 4. 1 мл цитратной плазмы крови мыши (пул 5 особей) разбавляют в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4, и наносят на колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы. Элюирование проводят в два этапа: сначала промывка, а затем связанный плазминоген элюируют 0,01 М раствором е-аминокапроновой кислоты (пример 1).

При этом ДЕ 0,055; Vi 1 мл; V2 2 мл.

Концентрация 0,055 2

17 1

плазминогена 10 0,065 мг/мл.

Пример 5. 2 мл цитратной плазмы

крови свиньи разбавляют в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4, и наносят на колонку, заполненную 2 мл лизин-агарозы. Последующие операции элюирования осуществляют, как описано в примере 1.

При этом ДЕ 0,102; Vi 2 мл; V2 4 мл.

Концентрация плазминогена

0,102-4

17-2

10 0,120 мг/мл.

Пример 6. 2 мл цитратной плазмы крови собаки разводят в 2 раза 0,05 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,4. Последу- ющие операции элюирования осуществляют, как описано в примере 1.

При этом ДЕ 0,063; Vi 2 мл; Чг 3 мл.

Концентрация плазминогена

0,063 3 ,п ппсс , -17 . „ х 10 0,056 мг/мл.

Для доказательства достоверности и точности нового метода полученные результаты сравнивают с известными из литературных источников данными: количество плазминогена в плазме крови в норме составляет в соответствии с литературными данными 1,5-2jU.M или в среднем 0,158 мг/мл; 0,120 мг/мл, а у 12 больных ревматоидным артритом в плазме 0,172 и синовиальной жидкости 0,065 мг/мл при определении иммунохимическим способом. Результаты, получаемые согласно предлагаемому способу, составляют в плазме крови

для здорового человека 0,135 ±0,0037 мг/мл, у больных ревматоидным артритом - 0,171 ± 0,115, у пациентов болезнью Крона она колеблется от 0,080-0,120 мг/мл; в синовиальной жидкости количество плазминогена у 16 больных ревматоидным артритом в период обострения составляет 0.0668 ± 0,0079 мг/мл.

Использование нового метода определения плазминогена позволяет значительно

сократить время анализа (1 ч по сравнению с 24 ч по способу-прототипу). При этом точность метода сохраняется достаточно высокой, что соответствует литературным данным и результатам экспериментального

анализа и клинических исследований.

Использование способа позволяет также проводить определение плазминогена у различных животных не зависимо от видовой специфичности.

Формула изобретения

Способ определения содержания плаз- миногена в биологической жидкости путем разделения и детектирования продукта, о т- личающийся тем, что, с целью ускорения способа и устранения зависимости от видовой специфичности объекта исследования, биологическую жидкость разбавляют в два

раза 0,05 М фосфатным буфером, проводят элюирование на сорбенте лизин-агароза в соотношении сорбент: биологическая жидкость (1-2): 1.0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4 и 0,01-0,1 М раствором Ј-аминокапроновой кислоты в 0,05 М натрий-фосфатном буфере и в элюате определяют плазминоген спектрофотометрически.

Способ относится к медицинской биохимии и может быть использован в клинико- лабораторной практике при диагностике и лечении заболеваний, связанных с патологией системы гемостаза. Цель изобретения - ускорение способа. Для достижения цели биологическую жидкость разбавляют 0,05 М фосфатным буфером, затем на сорбенте ли- зин-агароза в соотношении сорбент - биологическая жидкость (1-2):1 проводят элюирование последовательно 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,4 и 0,01-0,1 М раствором Ј-аминокапроновой кислоты в указанном буфере, после чего спектрофото- метрически определяют количество плазми- ногена в элюате. Способ позволяет также устранить зависимость от видовой специфичности обьекта исследования. 1 табл. w е