Способ очистки @ -глюканазы Советский патент 1987 года по МПК C12N9/38 

1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментной отрасли микробиологической промышленности, и может быть использовано в производстве очищенной 1,3-1,4-/3- -глюканазы, свободной от примеси сопутствующих ферментов и других балластных веществ, фермент может использоваться в аналитических целях для изучения структуры глюканов.

Цель изобретения - ускорение процесса очистки и повышение выхода целевого продукта.

На чертеже приведены зависимости влияния концентрации CaCl на степе осветления ферментного раствора и потери ft -глюконазы при фильтрации, где 1 - степень осветления фильтрат по сравнению с исходным раствором; 2 - потери фермента с балластным осадком.

Способ заключается в том, что на стадии приготовления ферментного раствора к используемой для. рас

- 2,

ворения воде добавляют 10 М СаСТг. При данной концентрации СаС удается добиться максимального осветлени препарата за счет отделения балластных белков при минимальной потере целевого продукта. Замена диализа гельфильтраЦией на сефадексе G-25 при скорости элюции 0,4-0,5 м/см мин позволяет ускорить очистку и увеличить выход фермента. Увеличени выхода фермента достигается также введением в ферментный раствор (перед хроматографией) цистеина или глутатиона в количестве 0,03-0,05 м на единицу активности jb -глюканазы. Отсутствие данных о роли сульфогид- рильных групп в р -глюканазе свидетельствует о неочевидности действия цистеина и глутатиона на выход фермента. Применение указанной совокупности признаков позволяет ускорить процесс очистки на 24-45 ч и увеличить выход от 19,4 до 32,8%.

Пример 1. Для получение высо крочищенного препарата р-глюканазы 50 г протосубтилин ГЮх с глюканаз- ной активностью 250 ед/г и содержанием белка 110 мг/г растворяют в

500 мл дистиллированной воды, содержащей 10 М СаС. Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием. Прозрачный ферментный раствор, содержащий нейтральную протеиназу, ft-глю- каназу и oi -амилазу активностью

10

15

20

ь

- 25

3338072

/i-глюканазы 23,3 ед/мл и содержанием белка 10,2 мг/мл направляют на обес- соливание. С этой целью используют гель-фильтрацию на сефадексе G-25, загруженном в- колонку размером 50x800 мм.. Сефадекс уравновешивают 10 М фосфатньтм буфером рН 7,0, содержащим 0,005 М СаС. На колонку наносят 500 мл ферментного раствора со скоростью 0,4 мл/мин СМ и после гель-фильтрации получают обессоленную фракцию объемом 2000 мл, содержащую 4,6 ед/мл /i-глюканазы и 2 мг/ип белка. Полученный ферментный раствор поступает на ионообменную хроматографию, которая проводится на карбокси- метилцеллюлозе (КМ-целлюлозе), загруженной в колонку размером 140x140 мм.

-2

Ионнообменник уравновешивают 10 М фосфатным буфером рН 7,0. Для улучшения очистки и повышения выхода Р-глюканазы на стадии ионообменной хроматографии в обессоленный ферментный раствор вводится цистеин в расчете 0,03 мг на единицу активности фер мента. После нанесения обессоленного ферментного раствора колонку промывают 3 л исходного буфера для полного удаления с КМ-целлюлозы об -амилазы. Затем колонку промывают 2,5 л исходного буфера, содержащего 7-10 М NaCl. При этом происходит элюация протеолитической фракции. Затем проводят элюцию / -глюканазы исходным буфером, содержащим 1М NaCl, в результате последней элюции получают 800 мл раствора активностью -глюканазы 7 ед/мл и содержанием белка 0,5 мг/мл Б указанной фракции не обнаружено протеолитической и амило- литической активности. Концентрирование элюата /3 -глюканазы проводят методом ультрафильтрации через аце- татцеллюлозные мембраны типа УАМ-100 при рН раствора 7,0.В результате получают фракцию объемом 40 мл содержанием р -глюканазы 111 ед/мп и белка 7,4 мг/мл. Выход по активности по сравнению с исходным препаратом 35,5%. Удельная активность фермента повышена в 6,5 раза. После лиофили- зации получен высокоочищенный препарат р -глюканазы.

Выход фермента на стадиях очистки приведен в таблице.

По сравнению с известным способом выход I J -глюканазы увеличен в 1,8 раза (таблица).

30

35

40

45

50

55

П р и м е р 2. Способ получения высокоочищенного препарата /3 -глюка- назы из протосубтилина ГЮх аналогичен способу,описанному в примере 1, до стадии ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе. В данном случае перед нанесением на колонку с ионо- обменником в обессоленный ферментный раствор вносят глютатион из расчета 0,07 мг на единицу активности j) -глю- каназы. Для элюции: ai -амилазы, про- теиназы и |5 -глюканазы используют те же растворы, что и в примере 1.

проводят исходным буфером, содержащим 0,8 М NaCl, В результате получают 900 мл раствора активностью /3 тлюка,. назы 5,5 ед/мл и содержанием белка 0,4 мг/мл. В указанной фракции отсутствуют протеиназы и oi -амилаза. Концентрирование элюата -глюканазы проводят методом ультрафильтрации

10 через ацетатцеллюлозные мембраны

УАМ-100 при рН раствора 6;2, Концентрат фермента объемом 25 мл имеет Р -глюканазную активность 160 ед/мл

и содержание белка 10,9 мг/мл. Выход Фракция -глюканазы объемом 850 мл 15 по активности по сравнению с исход- имеет активность 7 ед/мл и содержа- ным препаратом 32%. Удельная актив- кие белка 0,4 мг/мл. В полученном ность фермента повьтается в 6,4 раза, растворе отсутствуют протеиназа и Далее концентрат высушивают лиофиль- 6 -амилаза. Концентрирование элюата но или выделяют /3 -глюканазу ацето20 ном. По сравнению с известным способом выход ft-глюканазы увеличен в 1,6 раза, а процесс очистки сокращен на 45 ч.

П р и м е р 4. Для получения высо- 25 коочищенного препарата/3-глюканазы 800 г протосубтилин ГЮх глюканазной

I -глюканазы проводят в условиях, описанных в примере 1. Концентрат объемом 25 мл содержит 190 ед/мп

|3 -глюканазы и 12,3 мг/мл белка. Выход по активности по сравнению с исходным препаратом 38%, удельная активность повышена в 6,7 раза. Далее

активностью 400 ед/г и содержанием белка 120 мг/г растворяют в 8,0 л

активностью 400 ед/г и содержанием белка 120 мг/г растворяют в 8,0 л

дгшстиллированной воды, содержащей

1.

концентрат высушивают лиофильно или осаждают глюканазу ацетоном. По сравнению с известным способом выход

/ -глюканазы увеличен в 1,9 раза, а зо Ю М СаСХ. Нерастворившнйся осадок степень очистки фермента увеличена отделяют центрифугированием. Прозрачна 6,3%.ный ферментный раствор активностью

П р и м е р 3. Способ получения - -глюканазы 37 ед/мл и содержанием высокоочищенного препарата /3 -глюка- белка 11,2 мг/мл направляют на обес- назы из протосубтилина ПОк аналоги- 5 поливание методом гель-фильтрации на чен способу,описанному в примере 1, до стадии гель-фильтрации на сефадек- се G-25. Колонку с сефадексом уравновешивают 2-10 М ацетатным буфером рН 6,2, содержащим 0,005 М CaCl.

На колонку наносят 500 мл ферментного раствора активностью Ь -глюканазы 23,3 ед/мл и содержанием белка 10,2 мг/мл, скорость гель- фильтрации

сефадексе G-25. загруженном в колонку размером 200x630 мм. Условия обес- соливания аналогичны описанным в примере 1 . Скорость фт-шьтрации 40 0,47 мл/см МИН. После гель-фильтрации получают фракцию объемом 20,0 л, содержащую 11,2 ед/мл /3-глюканазы и 3,3 мг/мл белка. В обессоленный ферментный раствор вносят глютатион в 0,5 мл/мин см . После гель-фильтрации g количестве 0,05 мг на единицу актив- получают 1800 мл обессоленного раст- ности /5-глюканазы и направляют на вора активностью -глюканазы 5 ед/мл колонку размером 110x160 см, загру- и содержанием белка 2 мг/мл. Б этот женную КМ-целлюлозой для проведеьтя раствор добавляют цистеин в количест- ионообменной хроматографии. Полное

gQ удаление об -амилазы с КМ-целлюлозы происходит в результате промывания колонки 20 л исходного буфера. Затем колонку промьтают 10 л исходного буфера, содержащего 710 М NaCl для буфера для элюции oi -амилазы. После gg элюции протеиназы. В результате этого проводят , элюцию нейтральной элюции исходным буфером, содержащим

Ш NaCl, получают 6,0 л раствора активностью |3-глюканазы 22 ед/мл и содержанием белка 3,3 мг/мл. Протеве 0,05 мг на единицу активности Р -глюканазы и наносят на колонку с КМ-цёллюлозой, уравновешенной 2-10 М ацетатным буфером при рН 6,2. Далее колонку промывают 3,5 л исходного

протеиназы, пропуская через колонку 3 л исходного буфера, содержащего 1510 М NaCl. Элюцию -глюканазы

проводят исходным буфером, содержащим 0,8 М NaCl, В результате получают 900 мл раствора активностью /3 тлюканазы 5,5 ед/мл и содержанием белка 0,4 мг/мл. В указанной фракции отсутствуют протеиназы и oi -амилаза. Концентрирование элюата -глюканазы проводят методом ультрафильтрации

через ацетатцеллюлозные мембраны

УАМ-100 при рН раствора 6;2, Концентрат фермента объемом 25 мл имеет Р -глюканазную активность 160 ед/мл

и содержание белка 10,9 мг/мл. Выход по активности по сравнению с исход- ным препаратом 32%. Удельная актив- ность фермента повьтается в 6,4 раза, Далее концентрат высушивают лиофиль- но или выделяют /3 -глюканазу ацетоактивностью 400 ед/г и содержанием белка 120 мг/г растворяют в 8,0 л

дгшстиллированной воды, содержащей

1.

Ю М СаСХ. Нерастворившнйся осад отделяют центрифугированием. Прозра ный ферментный раствор активностью

- -глюканазы 37 ед/мл и содержанием белка 11,2 мг/мл направляют на обес- поливание методом гель-фильтрации на

сефадексе G-25. загруженном в колонку размером 200x630 мм. Условия обес- соливания аналогичны описанным в примере 1 . Скорость фт-шьтрации 0,47 мл/см МИН. После гель-фильтраинаэа и «i -амилаза отсутствуют в этой фракции. После концентрирования полученного элюата методом ультрафильтрации через мембраны типа УАМ-100 при рН раствора 7,0 получают концентрат объемом 200 мл, активностью jb -глюканазы 530 ед/мл и содержанием белка 24,3 мг/мл. Выход фермента по сравнению с исходным ю препаратом 33,1%. Удельная активность фермента повьшается в 6,6 раза. После лиофилизации или осажл;ения ацетоном получают высокоочищенный препарат р -глюканазы. Сокращают 15 процесс на 42 ч.

Примерз. Способ получения высокоочищенного препарата -глюканазы из протосубтилина Г10х аналоги- - чей способу, описанному в примере 1, до стадии ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе. Перед этой стадией обессоленный ферментный раствор вносят глютатион в количестве 0,08 мг на единицу активности -глюканазы. Элюция -глюканазы проводится в тех же условиях, которые описаны в примере 1. Фракция -глюканазы объемом 320 МП имеет активность 7,3 ед/мл и содержанием белка 0,4 мг/мл. В по- 30 лученном элюате отсутствуют протеина- за и oi -амилаза. Концентрирование фракции р -глюканазы проводят в условиях, описанных в примере 1. Концент20

ных белков целесообразно вносить СаС в кон центрации 10 М. Эта концентрация оптимальна, так как обеспечивает получение фильтрата ферментного раствора необходимого качества при сравнительно небольших потерях -глюканазы с, балластным осадком (чертеж).

Увеличение скорости элюции с се- фадекса G-25 до 0,6 мл/см мин или уменьшение до 0,3 мл/см мин приводит к значительному увеличению объема элюата, содержащего -глюканазу, т.е. к разведению ферментного препарата.

Пример 6. Я -глюканазу вьще- ляют как описано в примере 1, но

вместо протосубтилина Г10х в качестве исходного препарата используют осадок, полученный из культуральной жидкости осаждением этанолом. Выход фермента (от стадии культуральной 25 жидкости)33%.

Формула изобретения

Способ очистки /3 -глюканазы, включающий растворение исходного ферментного Препарата в воде, его обессоли- вание, хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе и концентрирование, о т- личающийся тем, что, с целью рат объемом 30 мл содержит 160,5 ед/мл g ускорения процесса очистки и повьше- Р -глюканазы и 194 мг/мл белка. Вы- ния выхода целевого продукта, фер- ход по активности по сравнению с исходным пр епаратом 38,5%, удельная активность повышена в 6,8 раза. Далее концентрат высушивают лиофильно или 40 глюканазу осаждают ацетоном. По сравнению с известным способом выход фией в ферментный раствор добавляют глюканазы увеличен в 1,98 раза. цистеин или глютатион в количестве На стадии приготовления фермент- 0,03-0,08 мг на единицу активности ного раствора для коагуляции балласт- Р-глюканазы.

ментный препарат растворяют в воде, содержащей 10 М CaClj обессолива- ние проводят гель-фильтрацией на сефадексе G-25 со скоростью 0,4 - 0,5 мл/см -мин, а перед хроматогра

ных белков целесообразно вносить СаС в кон центрации 10 М. Эта концентрация оптимальна, так как обеспечивает получение фильтрата ферментного раствора необходимого качества при сравнительно небольших потерях -глюканазы с, балластным осадком (чертеж).

Увеличение скорости элюции с се- фадекса G-25 до 0,6 мл/см мин или уменьшение до 0,3 мл/см мин приводит к значительному увеличению объема элюата, содержащего -глюканазу, т.е. к разведению ферментного препарата.

Пример 6. Я -глюканазу вьще- ляют как описано в примере 1, но

вместо протосубтилина Г10х в качестве исходного препарата используют осадок, полученный из культуральной жидкости осаждением этанолом. Выход фермента (от стадии культуральной жидкости)33%.

Формула изобретения

Способ очистки /3 -глюканазы, включающий растворение исходного ферментного Препарата в воде, его обессоли- вание, хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе и концентрирование, о т- личающийся тем, что, с целью ускорения процесса очистки и повьше- ния выхода целевого продукта, фер- фией в ферментный раствор добавляют цистеин или глютатион в количестве 0,03-0,08 мг на единицу активности Р-глюканазы.

ментный препарат растворяют в воде, содержащей 10 М CaClj обессолива- ние проводят гель-фильтрацией на сефадексе G-25 со скоростью 0,4 - 0,5 мл/см -мин, а перед хроматограПротосубтилинnOx

100

приготовление

ферментного

раствора

Гель-фильтрация

на сефадексе

G-25

44-45 55-60 59-65

79

80

80

100

92-93

70-73

32-33 40-45 41-47

80

26 32-35 33-38

Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения - ускорение процесса очистки и повышение выхода целевого продукта. Способ предусматривает растворение ферментного препарата / -глюканазы в воде, содержащей 10 М CaCl, обессолива- ние гель-фильтрацией на сефадексе G-25 со скоростью гель-фильтрации 0,4-0,5 мл/см мин, в полученный раствор добавляют цистеин или глюта- тион в количестве 0,03-0,08 мг на ед. активности р-глюканазы, после чего проводят очистку хроматографией на карбоксиметилцеллюлозе и концентрируют элюат методом ультрафильтрации. Удельная активность фермента повы- шается в 6-7 раз. Выход 1,6-1,9 раз. 1 табл., 1 ил. с S (Л

20

°/о потерь срермента

10-.

0,005 0,007 0,01

0,02

Редактор Н.Рогулич

0,05 Канц.

CaCl2,f

Составитель В Муронец

Техред Л.Олийнык Корректор С.Шекмар

Заказ 5670/24 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Гоеударственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производ твенно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

0,02