Способ получения инсулина человека Советский патент 1986 года по МПК A61K38/28 C12P21/00 

Изобретение относится к биохи в частности к получению инсулина ловека полусинтетическим путем.

Цель изобретения - повышение стоты и упрощение способа получе инсулина человека за счет испольвания модифицированного инсулина общей формулы.

дез(ВЗО)-инсулин- NH-CH-C-R

нс-сн.

I

он

где R - фенилаланил-фенилаланин, который подвергают обработке карбок- |5

сипептидазой А, специфически отщепля- -phe-phe выделяют хроматографическим ющей « Пример 2. ДАЙ растворяют в среде, состоящей на 60% из органической фракции (см. пример 1) и на 40% из 0,5 М трис-НС1 буфера до концентрации 32,2 г/л. Затем в этой среде растворяют трипептид thr-phe-phe-HCl до концентрации 0,047 М. С помощью . 0,1 М раствора NaOH доводят рН полученной смеси до 6,5. После этого в раствор вводят иммобилизованньА на силикагеле трипсин до концентрации 157 г/ли реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 3ч. ДАИ-thrостаток R с образованием инсулина человека.

Способ осуществляется следующим об-, разом.

Пример 1.В качестве исходного соединения используется дез (ВЗО)- -инсульта (ДАЙ), получаемый из инсулина свиньи по методу Schmitt. Сначала проводят связывание ДАЙ с три- пептидом thr-phe-phe. В качестве реакционной среды используют смесь, состоящую на 67% из органической фракции (смесь диметилформамида и этанола 1:1) и на 33% из 0,5 М трис-НС1 буфера. В этой среде растворяют навеску ДАЙ до концентрации 13,6 г/л и навеску трипептида до концентрации 0,067 М. С помощью 0,1 М раствора NaOH доводят рН полученной смеси до 6,5. Затем в раствор вводят трипсин

до концентрации 5 г/л и реакционную смесь инкубируют при в течение 35 мин. ДАИ-thr-phe-phe вьзделяют из реакционной системы хроматографическим способом и подвергают лиофили- зации. Выход составляет 54%. ДАИ-thr- phe-phe растворяют в 0,2 М растворе бикарбоната аммония с рН 8,5 до кон20

30

способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата 27%; Превращение ДАИ- -thr-phe-phe в инсулин человека и наделение инсулина проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. ДАЙ растворяют в среде, составленной по примеру 2, до концентрации 25,2 г/л. Затем рас- творяют трипептид thr-phe-phe-HCl до концентрации 0,037 М. С помощью 0,1 М раствора NaOH доводят рН полученной смеси до 6,3. После этого в раствор вводят иммобилизованную на силикагеле лизилэндопептидазу до концентрации 77 г/л и реакционную смесь инкубир5гют при 37°С в течение 48 ч, ДАИ-thr-phe-phe вьщеляют хроматографическим способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата 38%. Превращение ДАИ-thr-phe-phe в инсулин человека и ввделение инсулина проводят по примеру Г.

Идентичность получаемого препарата с инсулином человека подтверждена данными аминокислотного анализа, свидетельствующего о полном соответствии аминокислотного состава, получаемого препарата и инсулина челове35

40

цеитрации 2,8 мг/мл. К этому раствору 45 ка. Высокая чистота (гомогенность)

добавляют 2 мкл (2,3 Е) карбоксипеп- тидазы. Ферментативную реакцию останавливают через 30 мин путем добавления равного объема 0,5 М раствора лимонной кислоты. Образующийся инсу-phe-phe выделяют хроматографическим

ЛИН человека вьщеляют с помощью кристаллизации.

Пример 2. ДАЙ растворяют в среде, состоящей на 60% из органической фракции (см. пример 1) и на 40% из 0,5 М трис-НС1 буфера до концентрации 32,2 г/л. Затем в этой среде растворяют трипептид thr-phe-phe-HCl до концентрации 0,047 М. С помощью . 0,1 М раствора NaOH доводят рН полученной смеси до 6,5. После этого в раствор вводят иммобилизованньА на силикагеле трипсин до концентрации 157 г/ли реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 3ч. ДАИ-thr-phe-phe выделяют хроматографическим

0

0

способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата 27%; Превращение ДАИ- -thr-phe-phe в инсулин человека и наделение инсулина проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. ДАЙ растворяют в среде, составленной по примеру 2, до концентрации 25,2 г/л. Затем рас- творяют трипептид thr-phe-phe-HCl до концентрации 0,037 М. С помощью 0,1 М раствора NaOH доводят рН полученной смеси до 6,3. После этого в раствор вводят иммобилизованную на силикагеле лизилэндопептидазу до концентрации 77 г/л и реакционную смесь инкубир5гют при 37°С в течение 48 ч, ДАИ-thr-phe-phe вьщеляют хроматографическим способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата 38%. Превращение ДАИ-thr-phe-phe в инсулин человека и ввделение инсулина проводят по примеру Г.

Идентичность получаемого препарата с инсулином человека подтверждена данными аминокислотного анализа, свидетельствующего о полном соответствии аминокислотного состава, получаемого препарата и инсулина челове5

0

получаемого препарата инсулина человека доказана методом жидкостной хроматографии высокого давления (один основной пик при времени удержания 1089).