Способ получения плазмина Советский патент 1986 года по МПК C12N9/68 C12N9/72 

Изобретение относится к медицине а именно к прикладной биохимии, и может быть использовано для .поиска ингибиторов фибринолиза, определения гемостазиологических показателей.

Цель изобретения - повышение чистоты целевого продукта и упрощение способ а путем введения в растворы плазминогена систем генерации кислородных радикалов и исключения дефицитного белкового активатора плазминогена - стрептокиназы.

Способ осугдествляют следующим образом.

Готовят растворы плазминогена, вводят в них активаторы, образ тощие систему генерации кислородных радикалов и представляющие донор электронов и компонент с оксидазной функцией, при этом в качестве донора электронов используют W, N , N , М -тетраме- тилэтилендиамин, а в качестве компонента с оксидазной функцией - рибофлавин при следукщем соттношении компонентов, моль:

N,N , N,N -тетра

2. -10 10 - 4 -10

и проводят инкубацию плазминогена и системы генерации кислородных радикалов при 15-37 С в течение 10 - 30 мин.

N ,N, N , м -Тетраме- тилэтилендиамин Рибофлавин

Затем образец 1 инкубируют при 12 с в течение 5 мин, образец 2 - при 15°С 10 мин, образец 3 - при 20 мин, образец 4 - при 37°С 30 мин, образец 5 при 40 С 35 мин. После окончания инкубации по 0,03 мл каждого образца наносят на фибрино- вую пластину для определения прироста фибринолитической активности плаз- мина.

Результаты исследований сведены в табл.1.

Как видно из табл.1, введение в растворы плаэминогена системы генерации кислородных ра;: икалов увеличивает активность плазмина в образцах 2 - 5 в сравнении с образцом 1 на 380, 435, 380 и 330% соответственно. При этом увеличение содержания компоненКроме того, в качестве системы генерации кислородных радикалов могут быть использованы железо закис- ное сернокислое, рибофлавин и нико- тинамидадениндинуклеотид восстановленный П1ЭИ следующем соотношении компонентов, моль:

Железо закисное сернокислое 1 ибоЛлавин Никотинамид- адениндинук- леотид восстановленный

10 -9 10 4.10

4

10

-9

или феназинметосульфат иникотинамид- аде)1индияуклеотид восстановленный при следующем соотношении компонентов , моль :

Феназинметосульфат 2 Никотинамидаденин- динуклеотид восстановленный 2

10- 10- 4- 10

-5

4.10

-3

Пример 1, Готовятся пять одинаковых образцов плазминогена. В образец I систеьгу генерации кислородных радикалов не вводят. В образцы 2-5 вводят систему генерации кислородных радикалов, представляющую V, N,м;N -тетраметилэтилендиамин ирибо- гЬлавин при следующем соотношении компонентов, моль:

6- Ю 10 2 -10 7 -10 4ПО В-Ю

тов системы генерации кислородных радикалов в образце 5 по сравнению с образцом 4, а также увеличение теьше- ратуры и времени не приводит к дальнейшему возрастанию активности плаз- мина .

Приме р 2. Готовят пять одинаковых образцов плазминогена. В образец I систему генерации кислородных радикалов не вводят. В образцы 2-5 вводят систему генерации кислородных радикалов, представляющую железо закисное сернокислое, рибофлавин и никотинамидадениндинуклеотид восстановленный при следующем соотношении компонентов, моль:

Железо 2 343 закисное сер

-

10

-f

5-10

А. 10 4-10 4-10 10

-5

-5

4-10 9- 10 4-10 10

Дальнейшую обработку проводят аналогично примеру 1. Результаты исследований сведены в табл,2.

Из табл.2 видно, что введение в растворы плазминогена системы генерации кислородных радикалов увеличивает активность плазмина в образцах 2-5 в сравнении с образцом 1 на 25, 64, 64 и 41% соответственно. При зтом увеличение содержания компонентов системы генерации кислородных радикалов в образце 5 в сравнении с образцом 4, а также увеличение температуры и времени не приводит к дальнейшему возрастанию активности плазмина.

П р и м е р 3. Готовят пять одинаковых образцов плазминогена.

В образец 1 систему генерации кислородных радикалов не вводят. В об- разцы 2-5 вводят систему генерации кислородных радикалов, представляю

4

осульфат иникотинамнд- тид i сста}10Бленный соотношении компонен

2345

2.10 310 4-10 10

2-10 3

10 4

10 10

-г

5 I

Дальнейшую обработку проводят аналогично примеру 1. Результаты исследований сведены в табл.3.

Как видно из табл.3, введение в растворы плазминогена системы генерации кислородных радикалов увеличивает активность плазмина в образцах 2-5 в сравнении с образцом 1 на 18, 77, 59 и 18% соответственно. При этом увеличение содержания компонентов системы генерации кислородных радикалов в образце 5 по сравнению с образцом 4, а также увеличение температуры и времени не приводит к дальнейшему возрастанию активности плазмина.

Таблица 1

Концентрация, моль: N,N, N , N -тетра- метиленэтилен- диамин

рибофлавин Температура, С Время инкубации, мин

Фибринолитическая активность, усл. ед

3

6 10 10 2 .- 10

7 - 10 4 . 10 8 10

25 20

37 30

99,0 90,0

40 35

80,0

Концентрация, моль:

железо закисное сернокислое

рибофлавин никотинамид- аде ниндинук- леотид восстановленный

Температура, С Время инкубации,мин

Фибринолитическая активность, усл.ед.

О 10 5 10 9 5 - 10 О 4 10 4 10 4 10 10

О 4 . 10 9 10

12 5

15

10

25 20

35,4 43,9 58,4

4 10 10

37 40 30 35

58,4 50,0

Заказ 4588/27Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Таблица 2

4 10 10

25 20

58,4

37 40 30 35

58,4 50,0

Подписное