Способ определения активности никотинамидных дегидрогеназ Советский патент 1986 года по МПК G01N33/84 C12Q1/32 

«

Изобретение относится к физической биохимии, а именно к способам определения активности ферментов.

Цель изобретения - определение активности никотинамидных дегидро- геназ в гетерогенных системах за счет потенциометрической регистраци изменения концентрации протонов в реакционной смеси.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят регистрацию динамики рН в ходе реакций окисления восстановления никотинамидных коферментов. сопровождающихся изменением концентрации протонов в реакционных смесях в соответствии с уравнением

+ 2е +2И

(Ф)Н.

НАД(Ф)

-2е -2Н

При этом используют реакционную смесь, в которой изменение рН в ходе реакции пропорционально количеству протонов, вьщеляемых в реакционную смесь или поглощаемых из нее. При этом скорость процесса, как и по спектрофотометркческсму способу, оценивается по скорости окисления НАД(Ф)Н (или восстановле-ния НАД(Ф)) Скорость изменения концентрации НАД(Ф)Н или НАД(Ф) регистрируют по изменению рН реакционной смеси, имею

щей калиброванную буферную емкость. I

Чувствительность предлагаемого способа регистрации скорости реакций зависит от чувствительности рН реакционной смеси и высвобождения или поглощения протонов в ходе исследуемой реакции и связана с величиной буферной емкости реакционной смеси, которую предлагаемый способ позволяет варьировать в широких пределах. Для регистрации скорости окислительно-восстановительных превращений никотинамидных нуклеотидов достаточно обеспечить такую буферную емкость реакционной смеси, при которой сдвиг рН на 0,1 ед. происходил бы под влиянием добавления в реакционную с .месь 0,05-0,1 мкмоль соляной кислоты или гидроокиси натрия, что эквивалентно высвобождению или поглощению из среды такого же количества протонов. Непрерывную регистрацию измерения рН производят при помощи

559342

рН-метра, выходной сигнал которого пос тупает на самопишущий потенциометр. Оптимальный диапазон параметров рН-метра и самопишущего потен5 циометра должен обеспечивать отклонение пера самописца на 5-15 мм при изменении рН реакционной смеси на 0,01.

Потенциояетрическая установка,

О используемая для определения скорости окислительно-восстановительных превращений никотинамидных нуклеотидов, состоит из термостатированной- кюветы с магнитной мешалкой, рН-мет15 ра со стеклянным электродом и электродом сравнения в качестве датчика, подключенного к рН-метру,.а также самопишущего потенциометра для непрерывной регистрации сдвига рН,

20 наблюдаемого в ходе реакции, на величину 0,02-0,2 ед. рН. Начальное значение рН, при котором проводят реакцию, сожет варьировать в пределах 4,0-10.0. Общий объем реакцион25 ной смеси также может варьировать ..в пределах 2,5-15 мл и более, варьирование объема реакционной смеси производят, изменяя количество 9%-ного хлорида натрия.

30 Концентрацию буфера в реакционных смесях можно варьировать в пределах 0-0,05 М в зависимости от требуемой чувствительности определения. Концентрации субстратов и ни35 котинамидных коферментов могут быть любыми, но не менее 0,5-10 - 1-10 М. При использовании предлагаемого способа для определения активности дегидрогеназ концентра40)ции субстратов и коферментов должны соответствовать оптимальным значениям, т.-е. находиться в диапазоне 0,1 iO 3 -100 10 з М для субстратов, и 0, - для коферментов.

45 Пример 1. Лактатдегидро- геназная реакция освобождение протонов в среду (если реакция протекает в прямом направлении) или захват их из среды (если реакция протекает

5Q в обратном направлении) определяется уравнением

Молочная кислота + НАД пиро- виноградная кислота + НАДИ + Н .

В соответствии с этим уравнением 55 в прямой реакции можно наблюдать восстановление НАД и высвобождение в среду эквимолярного количества протонов. В обратной реакции происходит окисление НАДН и захват из среды протонов в состав молекулы молочной кислоты. Равновесие этой реакции резко сдвинуто в сторону окисления НАДН, т.е. в сторону обра- зования молочной кислоты. Поэтому для определения активности лактат- дегидрогеназы предпочтительнее поль зоваться реакционной смесью, содержащей исходно пируват и НАДН, а не лактат и НАД.

Реакционная смесь имеет сое-. тав, приведенный в табл. 1.

Потенциометрический анализ реакционной смеси проводят в следующем порядке:

1.В термостатированную при 37°С кювету объемом 4,0 мл приливают дистиллированную воду и промывают находящиеся в кювете электроды, включая магнитную мешалку. После промывания электродов воду удаляют.

2.Вносят в кювету реакционную смесь (компонент 1-4, табл. 1)

и погружают электродную пару так, чтобы не было препятствий перемешиванию содержимого кюветы магнитной мешалкой.

3.Производят запись изменения

рН в реакционной смеси при помощи согласованного с рН-метром самопишущего потенциометра.

На чертеже приведена кривая изменения рН при лактатдегидрогеназной реакции окисления НАДН, где а - момент начала регистрации рН в реакционной смеси, состоящей из компонент 1-4 (табл. 1); S - внесение в реакционную смесь компонента 5; о-г - калибровка буферной емкости реакционной смеси 0,01 мкмоль .(0,02 мл) соляной кислоты; h - сдвиг пера самопишущего потенциометра, обусловленный защелачиванием реакционной смеси за счет накопления продуктов реакции, взятый в пересчете на десятиминутный интервал времени, мм/мин; Н - сдвиг пера самопишущего потенциометра после быстрого внесения 0,01 мкмоль соля- ной кислоты;i - время.

Начальная скорость изменения рН соответствует участку а - S .

4.Приливают компоненту 5, запускающий регистрируемую фермента- тивную реакцию (для лактатдегидрогеназной реакции это - раствор пиру- вата)J и производят запись изменения рН за счет специфического окисления НАДН. Для этого достаточно 5-10 мин (участок 5 - & ).

5.Калибруют реакционную смесь, добавляя 0,02-0,1 мкмоль НС1 в 0,05-0,2 мл (скачок рН вследствие добавления кислоты обозначен моментом & - участок F) - г ) .

6.После записи реакции и проведения калибровки реакционную смесь удаляют, кювету и электродную пару трехкратно промьшают водой по п. 1.

Вычисление скорости окисления НАДН проводят, используя данные, полученные при записи потенциомет- рической кривой.

Скорость ферментативного окислен НАД вычисляют по формуле

X 5 X 60 0,06 h/H

где b - активность фермента в пробе, мкмоль/ч;

h - сдвиг пера самописца за счет специфического изменения рН в ходе ферментативной реакци за 10 мин, мм.

Определение активности лактатде- гидрогеназы в окисления НАДН потенциометрическим способом в образце фермента дает результат, соответствующий спектрофотометрическому определению активности. Активность лактатдегидрогеназы, выявленная потенциометрическим способом, составляет 4,4510,48 мкмоль/ч мл, по спектрофотометрическому способу 4,7± 0,62 мкмоль/Ч МЛ.

Пример 2. Определение активности алкогольдегидрогеназы потенциометрическим способом можно осуществить, пользуясь реакционной смесью состава, представленного в (табл. 2).

Выполнение анализа проводят так же, как и в примере 1.

В табл. 3 представлены результаты определения активности лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы.

Пример 3. При помощи потен- циометрического способа возможно определение активности дегидрогеназ в гетерогенных системах. В качестве примера реализации способа в гетерогенных системах проведена серия определений активности лактатдегид- рогеназы в реакционно смеси.

S12559346

содержащей активированный уголь (один риментах, проведенных потенциометри- из сорбентов, применяемых при гемо- ческим способом, установлено снижение активности лактатдегидрогеназы с 4,45±О.А8 мкмоль/ Ч Мл в реакцион- 5 ной смеси, не содержащей уголь, до 1,80±0,14 в реакционной смеси с активированным углем в качестве адсорсорбции). Данное исследование спект- рофотометрическим способом провести невозможно вследствие оптической непрозрачности реакционной смеси, содержащей взвесь угля в условиях постоянного перемешивания..В экспебента (табл. 3). Таблица 1

Компонент

ОбтзеМ;, название, концентрация и рН вносимого компонента

2 мл 9%-ного NaCl, доведенного 0,1 М NaOH до рН 8,20

0,05 мл 0,05 М трис-НС буфера, рН 8,20

0,2 мл М НАДН

0,55-0,05 мл препарата, содержащего неизвестное количество лактатдегидрогеназы

0,2 мл М раствора пирувата натрия, рН 8,20

Общий объем реакционной смеси доводят водой до 3 мл

2 мл 9%-ного NaCl, доведенного 1 М NaOH до рН 8,20

0,05 мл 0,0514 М трис-НС1 буфера, рН 8,20

0,2 мл 0,01 М НАД

0,055-0,05 мл препарата, содержащего неизвестное количестве алкоголь- дегигдрогеназы

Ор2 мл 0,02 М раствора этанола, рК 8,2

Общий объем реакционной смеси доводят водой до 3 мл

бента (табл. 3). Таблица 1

Состав реакционной смеси

Раствор хлористого натрия

трис-НС буфер рН 8,0

Раствор НАДН

Раствор лактатдегидрогеназы Раствор пирувата натрия

Раствор хлористого натрия

трис-НС буфер, рН 8,0

Раствор

Раствор лактатдегидрогеназы Раствор молочной кислоты

Раствор хлористого натрия

трис-НС буфер, рН 8,0

Рзствор НАДН

Плазма крови человека, соде лактатдегидрогеназу

Раствор пирувата натрия

Взвесь 100 мг активированно угля, приготовленная на расворе хлористого натрия трис НС -буфер, рн 8,0

Раствор НАДН

Раствор лактатдегидрогеназы

Раствор пирувата натрия

Раствор хлористого натрия

трис-НС буфер, рН 8,0

Раствор НАД

Раствор алкогольдегкдрогена Раствор этанола

Формула изобретения

Способ определения активности ни- котинамидных дегидрогеназ путем инТаблица 3

Активность фермента, МКМОЛЬ/Ч МЛ

кубации фермента в реакционной смеси, содержащей буфер, субстрат-акцептор или донор электронов и никотинамид- ный кофермент, отличающийс я тем, что, с целью определения в гетерогенных системах, регистрируют изменение рН реакционной смеси во времени, затем добавляют стандартное количество кислоты в случае заще125593А10

лачивания среды или щелочи - в случае закисления среды, а активность дегидрогеназы определяют, сравнивая сдвиги рН в ходе реакции и при добавлении кислоты или щелочи.

Изобретение относится к способам определения активности ферментов. Цель изобретения - определение активности никотинамидньпс дегидро- геназ в гетерогенных системах путем потенциометрической регистрации изменения концентрации протонов в реакционной смеси. Регистрируют изменение рН реакционной смеси во времени. Добавляют стандартное количество кислоты в случае защелачивания среды или щелочи - в случае закислення среды. Активность дегидрогеназы определяют, сравнивая сдвиги рН в Ходе реакции и при добавлении кислоты или щелочи. 1 шт., 3 табл. с . (О

8,г 5 ., Ю

j 15

Редактор Н. Рогулич

Составитель Н. Гуляева Техред Л.Сердюкова

Заказ 4816/44

Тираж 778

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

Корректор Т. Колб

Подписное