Средство для лечения сахарного диабета Советский патент 1986 года по МПК A61K38/28 

«

Изобретение относится к медицине и касается средства для лечения сахарного диабета.

Цель изобретения - сокращение сроков лечения за счет подбора необ- ходимого количества гормонально-активных остроковых клеток и специфической их обработки.

Средство содержит 8-12-дневную

культуру островковых клеток поджелу- дочной железы новорожденных поросят и дополнительно сыворотку реципиента при следующем соотношении компонентов, мас,%:

8-12-дневная культура

островных клеток поджелудочной железы новорожденных поросят 1,34-1,62 Сыворотка реципиента , 1,45-2,87 Физиологический растворОстальноеСредство получают следующим образом.

Выделенные в асептических условиях поджелудочные железы новорожденных поросят помещают в стерильную колбу с охлажденным до 4 С раствором Хенкса и антибиотиками (1000 ед/мл пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина), В боксе железы пе- реносят в стерильную чашку Петри и измельчают глазными ножницами на кусочки размером 0,5-1 мм. Перекладывают измельченную ткань в стерильную колбу и промывают раствором Хенкса до отхождения промывных вод, После промывания раствор Хенкса сливают, а колбу вносят 3-5 мл рабочего раствора коллагеназы (0,1% в 0,3%- ном растворе трипсина), Раствор фер- мента наливают с таким расчетом, чтобы измельченная ткань была покрыта слоем жидкости толщиной в 15-20 м В колбу опускаю стерильный магнит, закрывают стерильной резиновой проб- кой и ставят колбу на магнитную мешалку для перемешивания. Скорость перемешивания должна быть такой, чтобы над магнитом образовалась небольшая воронка, а в колбе не проис- ходило образование пены, Дезагрегацию ткани проводят при температуре . Первую порцию клеток, отделившихся от кусочков ткани через 15-20 мин не используют, В дальней- шем через каждые 10 мин производят слив жидкости со взвешенными в ней клетками во флаконе емкостью 250 мл

0

5

0 5 0 5 0 5

152

с добавлением 50-70 мл среды 199 с 50% сыворотки для инактивации про- теолитических ферментов, К оставшейся ткани вновь добавляют раствор фермента и ставят на магнитную мешалку для ее дальнейшей дезагрегации. Такую процедуру повторяют несколько раз в течение 30-40 мин. По мере заполнения флаконов производят центрифугирование в течение 10 мин при 600-700 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочнуюжид- кость сливают, а осадок ресуспенди- руют в питательной среде, которая состоит из равных объемов среды 199, О, 5% гидролизата лактальбуми- на с добавлением 20% бычьей сыворотки и 100 ед/мл пенициллина. Взвесь клеток засевают во флаконы Карреля, Культивирование проводят при 37 С в течение 8-12 дней (время функциональной активности клеток), после чего начинается их постепенное физиологическое отмирание,

За 24 ч до пересадки состав питательной среды меняют. Для лучшего приживления трансплантата к равным объемам среды 199 и 0,5% гидролизата лактальбумина добавляют 1,5-3% сыворотки реципиента. Культуру, предназначенную для пересадки, отделяют от поверхности стекла при помощи 0,2%-ного раствора версена, С этой целью в .культуральные флаконы вносят несколько миллиметров подогретого до 37 С раствора с таким расчетом, чтобы клетки были покрыты слоем жидкости толш;иной в 1,5- 2 мм. Затем их помещают в термостат при З7 с на 15-20 мин, Б течение этого промежутки времени жидкость 3-4 раза осторожно перемешивают. Взвесь клеток отмывают от раствора версена питательной средой методом центрифугирования. Для трансплантации берут 50-70 млн, клеток культуры, добавляют 3-5 мл физиологического раствора и 0,045-0,15 мл (1,3- 3%) сыворотки реципиента и вводят больному. Сыворотку реципиента получают за 24 ч до пересадки культуры р-клеток путем забора крови в стерильных условиях (8-10 мл). Затем кровь ставят в холодильник на 2 ч при 4-6 С для отстаивания. После образования сгустка крови последнюю центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин.

3

Полученная сыворотка готова к применению.

При цитологическом анализе культур островковых клеток поджелудочно железы новорожденных поросят обнаружено 4 периода их развития: адаптационный (2-24 ч), интенсивного роста (2-7 дней), стабилизации (8-12 дней) и физиологического отмирания (с 13 дня). Длительность этих перио дсГв зависит от количества посеянных клеток. Наибольшее количество инсулина изучаемая культура выделяет в период стабилизации (8-12 дней). За первые 7 сут культура выделяет 65- 80 мке/мл инсулина, на 8-12 сут.- 110-280 мке/мл инсулина. Начиная с 13 дня количество инсулина прогрессивно уменьшается и на 13-20 ден в культуральной среде определяют 30-40 мке/мл инсулина, последний определяют радиоиммунологическим методом.

Пример I. Б случае трансплантации культур с низким содержанием ингредиентов (островковых клеток 1,34 мае,%, сыворотки реципиента 1,45 мас,%, остальное - физиологический раствор) недостаточная эффективность способа связана с малым количеством |i-клеток, сниженной адаптацией культур клеток в организме реципиента.

Больной Я., 43 года. Производят трансплантацию островковых клеток поджелудочных желез новорожденных поросят (70 млн.) с содержанием сыворотки 1,34 мас.%. До трансплантации потребность в инсулине составляла . 90 ед.в сутки при колебаниях гликемии от 6,1 до 11,3 ммоль/л. Спустя 2 недели после трансплантации на фоне улучшения общего состояния суточная доза инсулина уменьшилась до 76 ад., колебания уровня гликемии в пределах 4,2-6,4 ммоль/л. Относительно удовлетворительное состояние наблюдалось в течение 4-6 мес.

Пример 2. При трансплантации культур с высоким содержанием

10

584154

ингредиентов (островковых клеток 1,62 мас.% сЁшоротки реципиента 2,87 мас,%, остальное - физиологический раствор) снижение эффектив- 5 ности применения способа обусловлено токсическим влиянием значительных концентраций сыворотки реципиента на |i-клетки. Больная Б. Производят : трансплантацию культур островковых клеток поджелудочных желез новорожденных поросят ( 120 млн.) с содержанием сыворотки 2,87 мас,%. До трансплантации суточная потребность в инсулине составляла 46 ед., колебания

5 уровня гликемии 6,1-1б-,3 ммоль/л. В течение 3 мес после проведенной ксенотрансплатации суточная потребность в инсулине уменьшилась до 32 ед, колебания уровня гликемии в преде0 лах 3,6-12,3 ммоль/л, .

Пример 3, Более благоприятное влияние на течение сахарного диабета отмечено при трансплантации средства с оптимальным содержанием

5 ингредиентов (островковых клеток 1,48 мас1%, сыворотки реципиента 2,16 мас.%, остальное - физиологический раствор).

Больная К,, 20 лет производят

0 трансплантацию культур островковых клеток поджелудочных желез новорожденных поросят (90 млн.) с содержанием сыворотки 2,.%. Перед трансплантацией потребность в инсу5 лине 210 ед, с колебаниями гликемии 4,4-16,3 ммоль/л при крайне лабиль ном течении заболевания. В течение 6-8 мес после трансплантации потребность в инсулине не снизилась до 76 ед,

0 течение заболевания приобрело стабильный характер.

Сравнительная оценка эффективности предлагаемого и известного способов лечения сахарного диабета по5 средством трансплантации культуры .островковых клеток поджелудочных желез плодов человека и культуры островковых клеток поджелудочных желез новорожденных поросят приведе« на в таблице.

На 40-44%

После 8 мес. после трансплантации

1-1,5 мес.

На 50-54%

Через 3-4 мес. после трансплантации

2-3 недели