Способ получения @ -клеток эндокринной части поджелудочной железы новорожденных Советский патент 1984 года по МПК A61K35/39 

со

05 со О5

Изобретение относится к медицине и биологии и может найти применение в эндокринологии, фармакологии, геронтологии, цитологии, гистологии, молекулярной биологии и в биофизике.

Известен способ получения ткани эндокринной части поджжелудочной железы эмбрионов 1.

Однако этот способ пригоден только для эмбриональной поджелудочной железы.

Известен также способ получения бетаклеток эндокринной части поджелудочной железы новорожденных крыс путем переваривания в смеси растворов коллагеназы и трипсира, многократным центрифугированием для промывания и осаждения клеток в градиенте фикола и последующего выращивания Б среде 199 с Ю /о-ной эмбриональной телячьей сывороткой, в виде монослоя 2.

Однако коллагеназа и трипсин влияют на нативные свойства клеток, повреждают, мембранные системы, тем самым влияют на сохранности и продуктивность исходного материала, искажают результаты исследований, при этом способ продолжителен (1 ч 5 мин).

Целью изобретения является повышение жизнеспособности целевого продукта, сохранение нативных свойств и упрощение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения р -клеток эндокринной части поджелудочной железы, новорожденных включающему измельчение железы новорожденных млекопитающих и человека и последующую обработку гомогената, поджелудочную железу предварительно выдерживают 1-3 ч в гидролизате лактальбумина с 5%-ной сывороткой для культур тканей и после измельчения проводят обработку раствором Хенкса или Эрла.

Способ осуществляют следующим образом. .

Поджелудочную железу удаляют в стерильных условиях через 30-40 мин после забоя новорожденных и помещают в гидролизат лактальбумина с б /о-ной сывороткой крупного рогатого скота на 1-3 ч для ингибирования процессов аутолиза. Затем удаляют соединительно-тканную капсулу и размельчают в течение 20-30 с глазными ножницами доводя до каидицеобразного состояния, и добавляют раствор Хенкса или Эрла. Промывают раскачиванием, удерживая флакон в горизонтальном Положении. Флакон оставляют в вертикальном положении до осаждения агрегатов, надосадочную жидкость удаляют. Этот процесс промывки повторяют 1-5 раз в зависимости от количества выделенных ферментов при измельчении и механическом повреждении экзокринных клеток, что контролируют при помощи фенола красного, содержащегося в растворе, с последующим просветлением надосадочной жидкости.

Сбалансированный солевой раствор сливают, целевой продукт заливают питательной средой, состав которой зависит от цели использования полученной суспензии.

Пример 1. Эндокринную часть поджелудочной железы новорожденных поросят удаляют в стерильных условиях, многократно промывают (3-5 раз) в охлажденном до 4°С сбалансированном солевом растворе с антибиотиками .(пенициллин 100 ед/мл стрептомицин 75 ед/мл) для полного уда5 ления элементов крови и профилактики заг рязнения флоры. Целевой материал помещают в стерильную чашку Петри, глазными ножницами, удаляют соединительно-тканную капсулу и крупные сосуды, затем переносят во флакон с гидролизатором лакталь бумина (с 5%-ной сывороткой) и оставляют на 1-3 ч при комнатной температуре для инактивации протеолитических ферментов экзокринной части. Жидкость удаляют сливанием. Глазными ножницами железу раз5 мельчают до кашицеобразного состояния и в течение 30-40 с заливают охлажденным до 4°С раствором Хенкса с антибиотиками для полного удаления протеолитических ферментов высвобожденных при механическом размельчении (иначе происходит слипание

фрагментов, что указывает на активное функционирование ферментов). Промывку размельченных фрагментов поджелудочной железы проводят раскачиванием флакона с целевым материалом в горизонтальном положении 1-2 мин, затем после осаждения фрагментов желеты, жидкость сливают. Промывку целевого материала таким путем проводят один-пять раз до тех пор, пока надосадочная жидкость станет прозрачной и рН среды останется нормальной (рН 0 определяют по сравнению с исходным раствором по изменению цвета индикатора - фенола красного. Солевые растворы используются производства ВНИИ полиомиэлита и вирусных энцефалитов АМН СССР).

Пример 2. Эндокринную часть поджелудочной железы мертворожденных детей удаляют и проводят последующую ее обработку по примеру I, используя вместо раствора Хенкса раствор Эрла.

0 При введении суспензии выделенной эндокринной части вышеизложенным способом нормальным крысам линии «Вистар подкожно выявлено хлопьевидное скопление клеток с вросшими капиллярами. Изучение гистологических срезов показало, что они морфологически не изменены. При введении суспензии эндокринной части поджелудочной железы крысам с аллоксановым диабетом обнаружены нормализация углеводного обмена, что указывает на функциональную активность трансплантата.

Использование способа позволяет выделять эндокринную часть поджелудочной железы новорожденных, сохранив ее нативные свойства, высокую гормональную активность, жизнеспособность, высокую продуктивность путем исключения использования диспергирующих экзогенных факторов с иммунореактивным инсулином 246- 325 мк ЕД/мл.

Способ прост, доступен, не требует дорогостоящих и дефицитных реактивов, сокращает затрату рабочего времени до 10- 15 мин, так как исключается необходимость применения коллагеназы и трипсина, а также центрифугирования, взбалтывания на магнитной мешалке при определенной температуре (что влияет на качество целевого продукта) и др.

Выделенные клетки эндокринной части поджелудочной железы арименяются в клинической практике для лечения сахарного диабета.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Э -КЛЕТОК ЭНДОКРИННОЙ ЧАСТИ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НОВОРОЖДЕННЫХ, включающий измельчение железы новорожденных млекопитающих и человека и последующую обработку гомогената, отличающийся тем, что, с целью повыщения жизнеспособности целевого продукта, сохранения нативных свойств и упрощения способа, поджелудочную железу предварительно выдерживают 1-3 ч в гидролизате лактальбумина с 5%-ной сывороткой для культур тканей и после измельчения проводят обработку раствором Хенкса или Эрла. (Л