Способ получения ферментированных спиртовых напитков Советский патент 1987 года по МПК C12C11/09 C12G1/02 

Изобретение относится к бродильной промышленности и может найти применение в пивоваренной, спиртовой и винодельческ-ой промышленности.

Цель изобретения - снижение содер- жания диацетипа.

Способ осуществляют следующим образом.

Сусло, содержащее углеводы, подвергают ферментации дрожжами и созре- ванию. Если сусло или виноградный сок ферментиру ют с помощью дрожжей или других микроорганизмов, помимо

Ферментацию ведут в две стадии: основная ферментация, которая длится 7-10 дн и вторичная фермента1Ц1Я - процесс созревания, который может длиться 3-12 нед. Во время основной

спиртовой ферментации происходят различные процессы, которые выз- 5 ферментации большая часть углеводов вать образование нежелательных побоч- в сусле превращается в этанол и дву- ных продуктов. Примером является об- окись углерода. Созревание проводят разование диацетила, который обладае при низких температурах в присут- сильньм и неприятным запахом даже ствии небольшого остаточного коли- в очень малых концентрациях, при 20 честна дрожжей. Целью созревания яв- этом спиртовые напитки, например ляется осаждение нежелательных высо- пиво или вино, могут приобрести неприемлемый вкус и аромат, если содержание диацетила превышает допустимую

25

его концентрацию.

Образование диацетила невыгодно также Б промьшшеннных процессах производства этанола, так как путем перегонки очень трудно отделить диаце- тил от этанола. Проблема возникает при получении абсолютированного этанола, если этанол дегидрагируют азе- отропной перегонкой с бензолом. Диа- цетил при этом накапливается в бензольной фазе во время азеотропной

НзС-С 0

с-он соон

с -аиешо актат

VH,

НзС-С-ОН

с

(5)

комолекулярных соединений и превращение диацетила, 2,3-пентадиона, с -ацетолактата и ot-ацето-о -оксибути- рата в такие соединения, как диоды, которые не изменяют запаха и вкуса. Например, бутандиол - конечный продукт превращения с/ -ацетолактата и диацетила в пиве - не влияет на вкус 30 и запах в концентрациях ниже 500 .«г/л

Ферментные и химические реакции важные для содержания в пиве днаце- тила можно проршлюстрировать на следующей схеме:

НаС-С 0

1 (даацетил

i(2)

Н

1

н с-с-он

(7)

СООН

(а-кето-|з- окшизо5алерат) СНзCfHs

с-он нзс-с-н

t (3)

НзС-С-ОН НзС-С ОН

н

(auemouH)

(2,3-&1//паноиоЭ

с-он соон

H

(a,ji-9uOKcuu3o5ajiepam)

перегонки, что мс;жет привести к образованию смесей диацетила и которые затрудняют регенерацию бей- зола, использованного для азеотроп- ной перегонки.

Варка пива включает ферментацию сусла прдходящим видом дрожжей, например, Saccharorayces cerevi.siae или Saccharomyces carlsfergensis.

Ферментацию ведут в две стадии: основная ферментация, которая длится 7-10 дн и вторичная фермента1Ц1Я - процесс созревания, который может длиться 3-12 нед. Во время основной

ферментации большая часть углеводов в сусле превращается в этанол и дву- окись углерода. Созревание проводят при низких температурах в присут- ствии небольшого остаточного коли- честна дрожжей. Целью созревания яв- ляется осаждение нежелательных высо-

ферментации большая часть углеводов в сусле превращается в этанол и дву- окись углерода. Созревание проводят при низких температурах в присут- ствии небольшого остаточного коли- честна дрожжей. Целью созревания яв- ляется осаждение нежелательных высо-

комолекулярных соединений и превращение диацетила, 2,3-пентадиона, с -ацетолактата и ot-ацето-о -оксибути- рата в такие соединения, как диоды, которые не изменяют запаха и вкуса. Например, бутандиол - конечный продукт превращения с/ -ацетолактата и диацетила в пиве - не влияет на вкус и запах в концентрациях ниже 500 .«г/л,

Ферментные и химические реакции важные для содержания в пиве днаце- тила можно проршлюстрировать на следующей схеме:

НаС-С 0

1 (даацетил

i(2)

Н

1

н с-с-он

t (3)

НзС-С-ОН НзС-С ОН

н

(auemouH)

(2,3-&1//панои

Предшественник диацетила of -аце- толактат вырабатывается в ферментирующих дрожжах за счет катализируемо ферментом конденсации пирувата и тиа минпирофосфата ацетальдегида и явля- ется промежуточным соединением в биосинтезе аминокислоты валина. Л-Ацето- лактат может таже самопроизвольно разлагаться через окислительное де- карбЬк силирование до образования ди- ацетила, реакция (1), который затем восстанавливается редуктазами в клетках дрожжей во время процесса вызревания пива. Декарбоксилирование ci-ацетолактата является реакцией, которая зависит от температуры и протекает относительно медленно при низких температурах, тогда как последующее превращение диацетила в ацето- ин и 2,3-бутандиод происходит отно- сительно быстро, вследствие чего стадией, определяющей скорость удаления с --ацетолактата и диацетила из пива, является декарбоксилирование диацетильиого предшественника. Аналогично стадией, определяющей скорость удаления 2,3-пентандиола и ог--ацето- - -аксибутирата, является спонтанное декарбоксилирование 2,3-пентандионо- вого предшественника.

Для достижения максимального осаждения высокомолекулярных продуктов и получения пива хорошего качества вызревание должно происходить при наиболее возможно низких температурах, например 0°С. При этой температуре оно может происходить несколько месяцев, прежде чем полностью удалится аце- толактат, и образовавшийся диацетшт восстановится дрожжами. Однако время вызревания можно уменьпшть, если предоставить возможность процессу протекать при более высоких температурах, например, до 1-2 нед при , или 1 -2 нед при 5 с или 1 или 2 нед - при -1°С. Такая процедура ускоряет превращение ацетолактата в диацетил.

Медленного разложения ацетолактата до диацетипа, реакция (1) на схеме можно избежать, используя для разло- жения ацетолактата ферменты. Для этой цели можно использовать любые ферменты. Все сводится к декарбоксилирова- нию ацетолактата до ацетона, реакция (4).

Целесообразно осуществлять превращение ацетолактата в «С-кето- - -оксиизовалерат с помощью изомеразы.

реакция (6), или превращение ацетолактата в 0 , Э-оксиизовалерат с помощью редукто-изомеразы, реакция (5) Продукты реакции в обоих случаях являются предшественниками аминокислоты валина.

Сусло обрабатывают ферментом, превращающим ацетолактат во время или после ферментации. Примером фер- мента является ацетолактатдекарбокси лаза, которую можно выделить из микроорганизма Aerobacter aerogenes.

Ауетолактат ферментативно декар- боксршируют до ацетоина, в результат удается избежать образования сильно пахнущего нежелательного диацетила из ацетолактата. Разложение Ы -ацетолактата до диацетила удается избежать за счет превращения предшественника диацетила с помощью ацетолак татных редукто-изомераз или изомераз, реакции (5) и (6).

Ацетолактатдекарбоксилазу можно добавлять во время основной ферментации или во время процесса созревания. Применение этого фермента приводит к значительному сокращению времени созревания, так как ацетолактат быстро декарбоксилируется до пригодного для ферментации ацетоина без какого-либо образования диацетила, фермент можно добавлять перед или во время основной ферментации, где рН Bbmie, нежели во время процесса созревания.

Вместо использования фермента в свободном состоянии его можно использовать в иммобилизованном состоянии, причем иммобилизованный фермент добавляют к суслу во время или при продолжении ферментации. Иммобилизован- ньй фермент можно также хранить в колонке, через которую пропускают ферментируемое сусло или пиво. Фермент можно иммобилизовать отдельно или использовать совместно иммобилизованные дрожжевые клетки и ацетолак- татдекарбоксилазу.

Применение иммобилизованного фермента позволяет ускорять продолжительность получения пива, так как ферментацию пива можно осуществлять, пропуская сусло через колонки, содержащие иммобилизованные дрожжи и иммобилизованные ферменты, необязательна в совместно иммобилизованном состоянии. Ксли процессы основной ферментации и созревания объединяют для

непрерывного превращения сусла в готовое пиво, производительность зависит от объема и диаметров колонн. Такой процесс уменьшает затраты труда и снижает себестоимость продукции Предлагаемый способ можно использовать не только для приготовления пива, но и для изготовления вина, гд достигаются аналогичные преимущества, в частности снижение времени вызревания и упрощение процесса. Интерес представляет использование ферментов, превращающих ацетолактат в связи с так называемой Ма1о- lactic ферментацией. Этот способ, который осуществляют с помощью таких микроорганизмов, как виды Leuconos- toc, Lactobacillus или Pediococcus, осуществляют после основной ферментации вина для повышения рН продукта также как и его биологической стабильности и для улучшения аромата вина. Однако такой способ может стат причиной потери аромата за счет диа- цетила, об)азование которого может быть понижено с помощью ацетолакт- превращающего фермента. Способ можно использовать при промышленном производстве этанола так, как продукты ферментации, которые получают и при этом не содержат или практически не содержаФ диацетила, что упрощает процесс дистилляции в случае азеотроп- ной перегонки для получения абсолютированного этанола, т.е. чистого безводного этанола.

Ацетолактаткарбоксилазу можно выделить, например, из Aerobacter aerogenes. Однако можно также использовать и ацетолактат-превращаю-. щие ферменты, полученные из других источников, например, видов Bacillus Enterobacter, Klebsiella, Leuconos- toc, Serratia u Streptococcus и неко Торых В1ЗДОВ Actinomycetes и грибков.

Подходящие ацетолактактные редук- то-изомеразы и изомеразы можно вьще- лить из бактерий, таких видов, как Е. Coli или Aerobacter aerogenes или из Neurospora crassa, дрожжей Salmonella или растений. Так как рассматриваются ферменты в аминокислотном метаболизме, еле дует ожидать их наличия почти во всех живых клетках.

Если процесс спиртовой ферментации 55лонку диаметром 10 см и высотой 5 см.

происходит при рН в интервале 4-5, аЧерез этот реактор прокачивают стемногие легко доступные ацетолактат-рнльное сусло при 10°С со скоростью

декарбоксилазы, выделенные из микро-0,15 л/ч, причем крепость сусла сосорганизмов, обладают оптимальной .тавляет 10,7°. Ослабление элюата на

стабильностью и активностью при рН вьш1е 5, целесообразно использовать ацетолактатдекарбоксилазу в химически кодифицированном состоянии для получения высокой стабильности и/или оптимальной активности в интервале рН 4-5.

Пример 1. Порционная ферментация и быстрое созревание пива

|С использованием ацетолактатдекарбок- силазы..

1 л стерильного сусла из сусла крепостью 10,7 инокулируют пивными дрожжами Saccharomyces carlstergensis

в количестве 20x10 клеток 1 л. Спустя 6 дн при 10 С процесс основной ферментации заканчивается, причем ослабление пива определяется как 2,0°Р. Содержание свободного и связанного диацетила (т.е. диацетила, полученного из ct-ацетолактата) в пиве определяют как 0,12 и 0,71 ч./млн. Затем пиво декантируют от выпавших в осадок дрожжей и смешивают со 100 мл

Kreusen , т.е. интенсивно ферментированного пива, полученного из сусла, инокулированного дрожжами за 48 ч до этого. Более того, добавляют 25 мг ацетолактатдекарбоксилазы, выделенной из Aerobacter aerogenes. После 24 ч выстаивания при для вторичного ферментирования и созревания определяют содержание свободного и связанного диацетила как 0,05 и

0,10 ч./млн соответственно. Затем пиво охлаждают до -1°С и оставляют выстаиваться в течение двух дней при этой температуре, а затем готовое пиво фильтруют.

Пример 2. Непрерывная ферментация и быстрое созревание пива.

250 г пивных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis, вьщеленных центрифугированием, суспендируют в 350 мл

3%-ного стерильного раствора натрий- ал ьгината. Эту смесь по каплям добавляют к 10 л стерильного 0,1 М СаС для желатинизации альгината кальция с образованием сферических, содержащих дрожжи частиц диаметром около 3 мм.

Их оставляют выстаиваться в раст-. воре хлористого кальция в течение 12 ч при 4°С, а затем набивают в ко7

выходе из реактора 2,1°Р, а по данн газовой хроматографии, содержание свободного и связанного диацет1гла 0,15 и 2,21 ч./млн соответственно. К 1 л пива из реактора добавляют 25 мг ацетолактатдекарбоксилазы. Пи оставляют выстаиваться при 10°С в течение 24 ч, а затем прокачивают через другой реактор с иммобилизоваными дрожжами, так что время пребы- вания составляет 5 ч. Содержание свбодного и связанного диацетила в эл ате определяют как 0,05 и О, 10 ч./мл соответственно. Затем температуру понижают до -1°С и после выстаивани в течение двух дней при этой темпертуре готовое пиво декантируют от осадка и окончательно фильтруют.

Пример 3. Порционная ферметация и быстрое созревание пива с применением ацетолактатной редукто- изомеразы.

1 л стерильного сусла ферментиру Saccharomyces carlsbergensis, как описано в примере 1. После 6 дн основной ферментации содержание в пив свободного и связанного диацетила по определению составляет 0,10 и 0,61 ч./млн соответственно. Пиво декантируют от остаточных дрожжей и добавляют 100 мп Kreusen, как описано в примере 1, вместе со 100 мг с --ацетолактат-редукто-изомеразы, по луч,енной из Е. coli. Затем пиво оставляют выстаиваться в течение еще 24 ч при 10°С, после чего определяю содержание в нем свободного и связаного диацетила, которое составляет 0,03 и 0,09 Ч./1-ШН соответственно. Затем пиво охлаждают до -1 С и ос- тавляют выстаиваться на 2 дн при эт температуре, а затем готовое пиво

Иммобилизованные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae вводят в виноградный сок, содержащий npiiMepHo 10% сбраживаемых карбогидратов. После 2 дн брожения свежеприготовленньш 35 раствор ацетолактатдекарбоксилазы добавляют в бродящую среду при концентрации 40 кЕ/л, после чего брожение продолжают еще 5 дн. Содержание ацетолактата вместе со свободным ди- ацетилом в содержащем фермент растворе определяют и оно составляет 0,10 чУмлн.

фильтруют.

Пример 5. Этот пример илПример 4. Получение фермен- 45 люстрирует иммобилизацию ацетолактатной декарбоксилазы в матрице геля альгината кальция. Влажные клетки штамма Bacillus Licheniformis, генерирующие ацетолактатную декарбокси- 50 лазу (50 г влажных клеток), суспендируют в 50 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия. В образовавшуюся суспензию добавляют 100 мл 4%-ного раствора альгината натрия, после 55 чего полученную смесь по каплям перета, способствующего созреванию вина.

Микроорганизмы Aerobacter aero- genes культивируют в 1 л среды, содержащей, г:

Na,jHPO , NaCl MgSO

12H20

CaCl FeSO MnCl

Глюкоза

6H /) ДН 0

1,5

9,0

1,3

1,5

0,15

0,45

0,02

0,01

90

носят в 0,1 M раствор хлорида кальция. Таким образом, получают небольшие гранулы альгипата кальция, содержащие ацетолактатную дскарбоксилаа

5

0

Q

Дрожжевой экстракт 10 Т риптоза10

Культивирование ведут в бродильном чане емкостью 20 л при 37 С и аэрации, клетки собирают в средне- экспоненциальной фазе путем центрифугирования и.затем промывают два раза фосфатным буфером при рН 6,8. Затем биомассу суспендируют в 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,8 п гомогенизируют в гомогенизаторе Мантон- Гаулина npii 600 атм. Разрушенные клетки затем удаляют центрифугированием и во всплывший при центрифугировании слой добавляют ионообменную смолу ДЕ-52, которую загружают в колонку и фермент элюируют фосфатом концентрацией от 20 мМ до 0,6 М при рН 6,8. Фракции исследуют на ферментную активность, активные фракции объединяют и к ним добавляют сульфат аммония в количестве 0,6 г/мл. Перед использованием фермента в процессе необходимое количество этой суспензии в сульфате аммония центрифугируют и полученный осадок растворяют в 20 мМ фосфатном буфере при рН 6,8 и подвергают диализу на фоне того же буфера.

Иммобилизованные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae вводят в виноградный сок, содержащий npiiMepHo 10% сбраживаемых карбогидратов. После 2 дн брожения свежеприготовленньш 5 раствор ацетолактатдекарбоксилазы добавляют в бродящую среду при концентрации 40 кЕ/л, после чего брожение продолжают еще 5 дн. Содержание ацетолактата вместе со свободным ди- ацетилом в содержащем фермент растворе определяют и оно составляет 0,10 чУмлн.

5

0

люстрирует иммобилизацию ацетолактатной декарбоксилазы в матрице гел альгината кальция. Влажные клетки штамма Bacillus Licheniformis, генерирующие ацетолактатную декарбокси- лазу (50 г влажных клеток), суспендируют в 50 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия. В образовавшуюся суспензию добавляют 100 мл 4%-ного раствора альгината натрия, после чего полученную смесь по каплям переносят в 0,1 M раствор хлорида кальция. Таким образом, получают небольшие гранулы альгипата кальция, содержащие ацетолактатную дскарбоксила

зу. Эти гранулы промывают 3 раза порциями по 500 мл фосфатного буфера при рН 7 и затем используют аналогично ,примеру 1.

Пример 6. Влажные, свежепри- готовленные клетки Bacillus Liche- niformis (50 г), производящие ацето- лактатдекарбоксилазу суспендируют в 250 мл О,1 М фосфатного буфера рН 6,0. Эту суспензию тщательно перемешивают при охлаждении до 5 С и при этой температуре в течение 30 мин по каплям добавляют 50 мл фосфатного буфера, содержащего 2,5% глутарового альдегида. Реакционную смесь затем выдерживают в течение 3 ч при 5°С, после чего клетки, содержащие ацето- лактатдекарбоксилазу, удаляют из реакционной смеси путем центрифугирования. В последующем эти клетки промывают 5 раз порциями по 250 мл фосфатного буфера. Полученный химически модифицированный фермент используют согласно предлагаемому способу, при этом химически модифициро- ванный фермент проявляет превосходну стабильность по сравнению с немодифицированным ферментом, причем рН находится в интервале 4-6.

Предлагаемый способ позволяет сог лано примеру 4 снизить содержание

Редактор Н. Рогулич Заказ 1228/58

Составитель А. Ульянова

Техред,л.Олейник Корректор М. Самборская

Тираж 500

Подписнх)е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

ацетолактата и свободного диацетила с 1,9 до 0,10 ч,млн,

Формула изобретения

1.. Способ получения ферментированных спиртовых напитков, предусматривающий ферментацию сусла дро7кжами, созревание его и введение в процессе ферментации или после него, или в процессе созревания фермента, о т- личающийся тем, что, с целью снижения содержания диацетила, в качестве фермента используют ацето- лактатдекарбоксилазу или изомеразу, или редуктоизомеразу,

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что фермент исполь.зуют в иммобштизованном виде.

3.Способ по п. 1,отличаю- щ и и с я тем, что дрожжи используют в иммобилизованном виде,

4.Способ по п. 1, о т л и ч ,9- ю щ и и с я тем, что ацетолактат- декарбоксилазу используют в химически модифицированном виде для обеспечения стабильности и/или активности ее при значении рН среды 4-5.

Подписнх)е

Изобретение относится к бродильной промьшшенности и может найти применение в пивоваренной, спиртовой и винодельческой промьшшенности. Целью изобретения является снижение содержания диацетила. Сусло, используемое для получения пива или этанола, или виноградный сок подвергают ферментации дрожжами с последующим его созреванием. В процессе ферментации или после нее, или- в процессе созревания вводят фермент, превращающий ацетолактат. В качестве фермента используют ацетолактатдекарбоксилазу или изомеразу, или редуктоизомеразу. Фермент и дрожжи используют в иммо- .билизованном виде. Ацетолактатдекарбоксилазу используют в химически модифицированном виде для обеспечения стабильности и/или активности ее при значении рН среды 4-5. 3 з.п. ф-лы. i ОТ с со о со о со 02 ы