Способ получения диагностических поливалентных сывороток для идентификации жгутикового антигена Y.ЕSснеRIснIа coLI Советский патент 1991 года по МПК A61K39/02 

m

IHofipcTPHiic ОТНПГ1Г1Ч я к области микроГшологии и может бють исмюльзо- иано р ир и шолствс ДНЯГПОСТИЧРСКИХ пропаратоп лля серологического типи- роряняя бактерий P .ColL, в том числе являющихся возбулнте;гями инфекциой- ньгх заболеваний.

Цель изобретения - упрощение иден тификгиши жгутикового антигена эше- рихий.

Способ осутпествляется следующим образом. Для иммунизащ1И животных - продуцентов сыворотки и адсорбции антител используют коллекцию штам- мое E.Coli, относящихся к одной и той же серологической группе 055:К59 (В 5) , но обладаю1 х рязньгми Н-ан- тигенами, в число которых входят ЗА разновидности: с HI по HI 2, с HI4 по Н21, с Н23 по Н49, с Н51 по Н56 и (номера штаммов в коллекции ГИСК им.Тарасевича, соответственно, с № 6Л по № 73, fr ДО, с № 74 по № 81, № 41, с № 82 по № 115 включи- тельно). Иммунизацию проводят штаммами С разными Н-антигенами, необходимыми для индукции у животных синтеза планируемых в составе поливалентной сыворотки Н-антител. В сыворот- ке крови, полученной от иммунизированных животных, определяют при помощи эталонных Н-тест-штаммов E.Coli специфическую активность и присутствие гетерологичных Н-антител, не запланированных в составе готового препарата сыворотки. Антитела к соматическим О- и К-антигенам, использованным для иммунизации штаммов, адсорбируют из поливалентной сыворотки каким-либо штаммом серогруппы 055:К59 (В5) с Н-антигеном, не соответствующим запланированным в сыворотке Н-антителам. При обнаружении в сыворотке гетерологичных Н-антител используют в качестве адсорбента штамм с Н-антигеном, соответствующим этим гетерологичньлм антителам, для одновременного удаления соматических и гетерологичных Н-антител.

Пример. Бульонные культуры хорошо подвижных штаммов серогруппы 055:К59 (В5) убивают формалином (0,5%) и соединяют в равных объемах для получения поливалентных вакцин. Состав вакцин представлен в табл.1. Его подбирают таким образом, чтобы получить 7 поливалентных сывороток.

5 о

5

0

5

0

5

)3

р которых лг глю инин|,1 к рлчным Н-ан- тигенам Омни бы рас прг делены в неповторяющихся сочетаниях для идентификации Н-антигенов бе-л применения моновалентных сыпоротчк (н данном примере только следующие пары антигенов: HI и Н12, НЗО и Н32, Н5 и , - из-за резко выраженных у них обших парциальных антигенных факторов нуждаются в дополнительной дифференциации при помощи моновалент- ных сывороток). Иммунизацию проводят внутривенно шестикратно с интервалами 4-5 дней в яозрастаюших дозах: 0,4, 0,8, 1,5, 2,0, 3,0 и 4,0 мл. Для детоксикации эндотоксина вакцины перед введением обрабатывают на- тивной стерильной ОК-сывороткой 055:К59 (В5) при 37°С 30-40 мин, которую добавляют в количестве 1/10 - 1/20 объема вакцины. Сыворотку считают пригодной для использования при титре специфических Н-антител 1:1600 и выше, определявшемся посредством пробирочной реакции агглютинации с эталонными Н-тест-штам-- мами эшерихий. Также при помощи эталонных Н-тест-1йтаммов, но посредством реакции агглютинации на стекле контролируют разведенную 1:10 сыворотку на присутствие гетерологичных Н-агглютининов. Диагностикумы для реакции агглютинации на стекле получают, выращивая бактерии 16-20 ч при 30°С на скошенном агаре, приготовленном из сухого питательного агара на рыбном гидролизате производства Дагестанского НИИ питательных сред, с добавкой 3% глицерина. Бактерии смывают изотоническим раствором хлорида натрия, содержащим 0,5% формалина, так, чтобы получить бактериальную взвесь густотой около 20 млрд. микробных клеток в 1 мл (по оптическому стандарту мутности) Сыворотки, в которых не обнаруже мы гетерологичные Н-антитела,адсорбируют каким-либо одним штаммом се- рогруппы 055:К59 (В5), не входящим в состав соответствующей поливалентной вакцины. Сыворотки, в кбторых обнаружены гетерологичные Н-антитела, адсорбируют штаммами 055: К59 (В5) с Н-антигенами, cooтвeтcтвyюlцим этим Н-антителам. Результаты контроля специфичности сывороток и штаммы, использованные для их адсорбции, прдеставлены в табл.2. °

3

Преимущество предлагаемого способа состоит в Повышении специфичности получаемых поливалентных сывороток, позволяющем упростить процес идентификации Н-антигенов без шения его диагностической эффективности, в частности относительного кбличества штаммов, у которых оказывается возможным идентифицировать Н-антиген, и правильности идентификации.

Повышение специфичности заключается в том, что сыворотки освобождают адсорбцией от антител к соматическим (О и К-) антигенам использованных для иммунизации щтаммов. Благодаря этому становится возможным проводить идентификацию посредством реакции агглютинации на стекле, тогда как сыворотки, получаемые известным способом, используют исключительно для реакции агглютинации в пробирках по специальной методике, предотвращающей образование а глютината при взаимодействии бактерий С содержащимися в сыворотках антителами к соматическим антигенам.

Результаты идентификации Н-антигенов у эталонных и диких штаммов E.Coli, выделенных из разных источников, показали, что приготовленные предлагаемым способом сыворотки не уступают по их диагностической эффективности сывороткам, полученным способом, избранным в качестве прототипа .

Преимущества, связанные с упрощением методики идентификации, иллюстрирует табл.3.

Правильность идентификации Н-антигенов была подтверждена при помощи моновалентных сывороток, т.е все полученные результаты были специфичны.

134

Существенной отяичнтгпьной характеристикой предлагаемого спосоРп является использование специально

созданного для его выгголнения производственного набсфа идентичных по соматическим антигенам гатамъшв (для иммунизации .животт)ых и адсорбции сывороток) вместо используемой с

этой целью и прототипе коллекции эталонных Н-тест-штаммов, обладающих разными соматическими антигенами, в том числе часто неизученными К-ан- тигенами. Это отличительная черта,

собственно, и обеспечивает возможность удаления из сывороток О- и К-антител (т.е. повышения их специфичности) и достоверного контроля их присутствия и полноты адсорбции.Кроме того, она обеспечивает возможность адсорбции одним штаммом О- и К-антител, индуцированных разными штаммами, использованными для иммунизации, а также возможность одновременного

удаления таких антител и готерологич- ньгх (не запланированных в составе поливалентной сыворотки) FI-антител. Формула изобретения Способ получения диагностических

поливалентных сывороток для идентн- (икации жгутикового антиг ена у . Escher ichia Coli ,пключаюц11й иммунизацию животных штаммами Е.СлН, содержащими различные Н-антигены с последующим определением гстероло- гичных Н-антител в сыворотке крови и их адсорбции, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения идентификации Н-антигена, иммунизацию осуществляют штаммами E.Coli, принадлежащими к одн ой и той же серологической ОК-группе (055:К59 (В5) серотинов с .HI по HI2, с HI4 по Н21, с Н23 по НА9, Н51 - Н56 и

, а адсорбцию сьгооротки проводят штаммами той же серогруппы.

51338153

Т а 6 j7 и u а 1

Состав поливалентных вакцин, использованных для иммунизации животных

Н-антигены штаммов серогруппы 055:К59(В5) включенных в состав поливалентной вакцины для получения соответствующей поливалентной сыворотки

Н1, Н2, Н6, Н7, Н9, Н12, HU, Н23, Н24, Н25, Н27, Н28, Н29, Н31, НЗЗ, Н34, Н38, Н51

НЮ, Н16, Н20, Н21, Н23, Н2А, Н25, Н26, НЗО, Н32, НЗЗ, Н36, Н39, Н42, Н52, НЗЗ, Н34

Н2, НЗ, НЗ, Н9, Н15, Н16, Н20, Н27, НЗЗ, Н36, Н43, Н44, Н43, Н46, Н31, НЗЗ,Н36,

Н8, НЮ, НИ, Н21, Н23, Н28, Н29, Н34, НЗЗ Н39, Н40, Н42, Н43, Н47, Н48, Н49, Н36

Н4, Н6, Н11, Н15, Н18, Н24, НЗ1, Н36, Н37, Н38, Н39, Н41, Н43, Н46, Н48, Н49, Н31, Н32

НЗ, Н7, Н9, Н16, И18, Н19, Н28, Н31, НЗЗ, Н40, Н41, Н42, Н43, Н48, Н32, Н34, НЗЗ, Н36

Н4, Н6, Н14, hta, Н20, Н21, Н23, Н26, Н27, H29j НЗЗ, Н43, Н44, Н46, Н47, Н49, Н35

Штаммы, использованные для адсорбции

Ю1

№ 78, № 79

87, № ЮО

№ 68

№ 78, 101

71, 97, 102

113

Таблица i.

Результаты контроля специфичности сывороток

Не обнаружены

гетерологическйе

Н-антитела

Н17, Н 18

Н28, Н41

НЗ

Н17, Н42

Н8, Н38, Н43

Не обнаружены

гetepoлoгичecкиe

Н-антитела

71338153

Т а

Упрощение процесса идентификации Н-антигенов при использовании сывороток, полученных предлагаемым и известным способами

При подготовке бактериальной культуры для исследования посредством реакции агглютинации в пробирках иследо- ваиие начинают на следующий день после добавления к культуре формалина. Результат пробирочной реакции агглютинации учитывают, либо четырехкратно (через 15, 30, 45 и 60 мии) в случае инкубации при или однократно после 2 ч инкубации при ЗУС и получаса при комнатной (17-25 С) температуре.

Составитель Г.Крюкова

Редактор Е.Месропова Техред В.Кадар Корректор В,Гирияк

--.-- - ------.-----------------------------------

Заказ 3728 .,/(- Тираж 2 у Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4

8 лица

Изобретение относится к микробиологии. Цель изобретения - упрощение идентификации жгутикового антигена эшерихий. По предлагаемому способу проводят иммунизацию животных штаммами с разными Н-аитигенами. В сыворотке крови этих животных определяют специфическую активность и присутствие гетерологических Н-ан- тител. Антитела к соматическим О- и К-антигенам адсорбируют из поливалентной сыворотки каким-либо штаммом серогруппы 055:К59 (В 5) с Н-ан- тигеном. При обнаружении в сыворотке гетерологйческих Н-антител используют в качестве адсорбента штамм с К-антигеном, соответствующим этим гетерологичным антителам, для одновременного удаления соматических и гетерологичных Н-антител. При этом повьппается специфичность получаемых поливалентных сьгеороток. табл. SS (Л с