Штамм бактерий Streptococcus dysgalactiae для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров Российский патент 2024 года по МПК C12N1/00 C12R1/46 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к получению нового штамма «SD-21» бактерий Streptococcus dysgalactiae и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики мастита коров.

В результате перевода скотоводства на промышленную основу, автоматизации производственных процессов возникает ряд проблем, негативно сказывающихся на физиологическом состоянии животных.

В современных условиях особое значение приобретает повышение качества молока, снижение себестоимости и обеспечение конкурентоспособности животноводческой продукции. Молоко является важным пищевым продуктом для людей и кормом для животных, что тем самым определяет его значимость. Выращивание полноценного молодняка зависит в значительной мере от состояния и функции молочной железы лактирующих коров [1, 2, 3].

Одной из самых серьезных проблем в молочном животноводстве были и остаются маститы коров. Заболевание широко распространено по всей территории Российской Федерации среди коров разных пород. Клинической и скрытой формами мастита во всех странах мира животные болеют в среднем от 17 до 20% коров, а в отдельных регионах заболеваемость достигает 50% [4]. В результате роста продуктивности обостряются проблемы здоровья вымени и оплодотворяемости коров. У многих животных, переболевших клинической формой мастита, молочная продуктивность не восстанавливается, в 10% и более случаев молокообразование в пораженной четверти вымени прекращается и происходит ее атрофия. В среднем в хозяйствах ежегодно выбраковывают до 17% коров [4, 5].

Экономический ущерб, причиняемый воспалением молочной железы, весьма значителен, что обусловлено потерей продуктивности животных, ухудшением биологических и технологических свойств молока, которое из-за содержания болезнетворных микробов становится к тому же опасным для человека и молодняка сельскохозяйственных животных. Подсчитано, что корова, перенесшая мастит, в текущую лактацию снижает удой примерно на 150-200 кг. С учетом массового охвата поголовья потери из-за мастита в молочной индустрии составляют 10-12% производимой продукции [4, 5, 6].

Экономический ущерб при маститах можно разделить на убытки, связанные с сокращением удоев и качеством молока (66 %), выбраковкой продукции из-за снижения пищевых и технологических свойств (6 %), преждевременным выводом из стада высокопродуктивных коров из-за нарушения функции четвертей вымени (22 %), повышением расходов на медикаменты для лечения животных (5 %), а также увеличением затрат на оплату труда ветеринарных специалистов (1 %). Косвенный, но существенный ущерб наносит выпойка молозива телятам от больных маститом коров, что как правило, приводит к массовым желудочно-кишечным заболеваниям и является одной из причин их гибели в раннем постнатальном периоде [6, 7, 8].

Воспаление молочной железы является полиэтиологическим и полифакторным заболеванием, развивающимся вследствие воздействия на неё механических, термических, химических и биологических факторов. При этом основное значение придается проникновению в вымя патогенных микроорганизмов, что приводит к более тяжелым воспалительным процессам в тканях молочной железы [1]. Поэтому наряду с исключением воздействия на организм предрасполагающих факторов особенно важным является устранение микроорганизмов - возбудителей мастита [9, 10].

Борьба с маститом может быть успешной лишь при своевременном обнаружении больных животных, а также оказании лечебной помощи на ранних стадиях воспалительного процесса вымени [11-15].

В настоящее время проведение традиционной профилактики и терапии осуществляется на основе использования химиотерапевтических средств. Однако повсеместное применение антибиотиков способствует появлению побочных явлений у людей и животных. Также установлено, что антимикробные препараты оказывают негативное влияние на иммунологическую реактивность организма, что может снижать эффективность лечения [16]. Кроме того, многие лекарства чрезвычайно дороги, и не нашли широкого применения в ветеринарной практике. Повсеместное и бессистемное использование большого количества препаратов, содержащих антибиотики, привело к тому, что образовались лекарственно устойчивые штаммы микроорганизмов, появился мастит грибковой этиологии [17-20].

В последние годы в нашей стране ведутся интенсивные работы по созданию новых, высокоэффективных противомаститных лекарственных средств антимикробного и противовоспалительного действия, допустимых к использованию в условиях современных животноводческих ферм. Однако их эффективность не всегда достаточно высокая и большинство препаратов имеют длительный период выведения.

Мастит - это инфекция молочной железы, обычно вызываемая бактериями или грибками. Среди видов бактерий, наиболее часто связанных с маститом, выделяют виды рода Streptococcus, в том числе Streptococcus uberis (далее по тексту - S. uberis) - нетипируемые, Streptococcus agalactie (далее по тексту - S. agalactiae)- группа Лансфилда B, Streptococcus dysgalactiae (далее по тексту - S. dysgalactiae) - группа Лансфилда C, Streptococcus zooepidemicus и группы Лансфилда Д, Г, Л и Н стрептококки. Некоторые из этих видов являются инфекционными (например, S. agalactiae), тогда как другие считаются патогенами окружающей среды (например, S. dysgalactiae и S. uberis) [9, 21, 22].

Возбудитель S. dysgalactiae серогруппы С обладает целым комплексом факторов вирулентности, к которым относят: О-стрептолизин, S-стрептолизин, М-белок, стрептококковый пирогенный экзотоксин и эндотоксин, стрептокиназа, эндопептидаза, адгезины и плазминогены. Поэтому эффективность специфической профилактики определяется наличием комбинации данных факторов в антигенном составе входящих в вакцину компонентов.

Известен штамм «ID9103» S. dysgalactiae, используемый для получения гиалуроновой кислоты, имеющей среднюю молекулярную массу 10 000 000 Да или более. Изобретение относится к технической области генной инженерии. Штамм S. dysgalactiae хранится в фармацевтической компании ILDONG PHARM CO LTD (США) под регистрационным номером KCTC11818BP. Штамм по изобретению может быть использован для получения гиалуроновой кислоты [23].

Известен вакцинный штамм «УР-16-ВБХ» стрептококкоза серогруппы С, используемый для изготовления поливалентной инактивированной вакцины против стрептококкозов свиней, способ ее получения и применения [24]. Способ получения вакцины включает культивирование производственных штаммов; инактивацию культуральной жидкости; концентрирование антигенов; определение полноты инактивации антигенов; составление серии вакцины; контроль стерильности и безвредности вакцины; определение иммуногенной и антигенной активности вакцины.

Известен штамм S. disgalactiae «SDS», который может быть использован для создания вакцинного препарата для специфической профилактики заболеваний рыб семейства лососевых [25]. Штамм с регистрационным номером CCTCC M 2018843 хранится в Уханьском университете с 2018 г.

Известен способ лечения и предотвращения мастита у субъекта, к интрамаммарным противомикробным ветеринарным композициям, применяемым в таких способах, и интрамаммарным ветеринарным композициям, применяемым в таких способах [26]. Способ включает в себя лечение или предотвращение мастита, вызванного бактериальной инфекцией, посредством введения композиции, содержащей терапевтически эффективное количество полиэфирного ионофора, наразин; салиномицин; лазалоцид; монензин; семдурамицин; мадурамицин и лаидломицин в молочную железу субъекта (интрамаммарное введение).

Известен способ лечения мастита у коров [27]. Способ лечения включает в себя внутримышечное введение препарата, содержащего вещества при следующем соотношении компонентов, мас. %: Марбофлоксацин - 9,5-10,5; Триметоприм - 2,375-2,625; Глюконолактон - 7,6-8,4; Маннитол - 2,85-3,15; Метилпирролидон - 9,5-10,5; Метакрезол - 0,04-0,06; ЭДТА - 0,002-0,003; Вода для инъекций - до 100. Причем препарат вводят один раз в сутки в течение 2-4 дней в дозе 10 мл. Способ позволяет повысить эффективность и сократить сроки лечения субклинического, катарального и гнойно-катарального мастита у коров.

Известен способ лечения маститов крупного рогатого скота [28]. Способ лечения включает в себя применение биологически активного препарата. Согласно изобретению, в качестве препарата используют биотинилированное производное окисленного декстрана, представляющее собой конъюгат, полученный реакцией гидрозида биотина и окисленного декстрана с молекулярной массой 40-70 кДа с образованием азометиновой связи. Раствор биотинилированного производного окисленного декстрана в дозе 0,05 мг/кг вводят внутримышечно каждые 72 часа, 3 инъекции, дополнительно к основной схеме лечения маститов. Технический результат заключается в сокращении срока лечения маститов крупного рогатого скота и обеспечении снижения количества соматических клеток в молоке.

Известна иммунизация молочного КРС белком GAPC против стрептококковой инфекции [29]. Настоящее изобретение относится к клонированию, экспрессии и характеристике плазмин-связывающих белков GAPC из S. dysgalactiae, S. agalactiae, S. uberis, Streptococcus parauberis и Streptococcus iniae и их применение в вакцинных композициях.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие штамм микроорганизма S. dysgalactiae «SD-21» аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».

Выделение штамма микроорганизма при мастите коров, и использование его в качестве производственного штамма, способствующего формированию иммунитета к циркулирующим патогенам, вызывающих мастит, который не влиял бы на качество молока и оказывал положительный экономический эффект, является актуальным направлением и будет способствовать обеспечению страны безопасной продукцией, снижению применения антибактериальных препаратов в животноводстве и за счет этого возможным выходом продукции на экспорт.

Технический результат заключается в расширении арсенала актуальных производственных штаммов бактерий вида S. dysgalactiae, обладающих новыми биологическими характеристиками, и пригодных для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита крупного рогатого скота.

Указанная проблема решена путем получения штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae, который может использоваться для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров.

Изолят S. dysgalactiae, послуживший источником для получения штамма «SD-21», был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2021 г. при проведении бактериологических исследований проб молока, от коров из хозяйства Владимирской области.

Штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae семейства Streptococcaceae рода Streptococcus вида Streptococcus dysgalactiae, депонирован во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №389 - деп / 22-23- ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики, экспериментально показана выработка антител на введение моновакцины, изготовленной из антигена данного штамма, лабораторным животным.

Штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологическая характеристика

Штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae относится к семейству Streptococcaceae, роду Streptococcus, виду Streptococcus dysgalactiae и обладает морфологическими признаками, характерными для бактерий рода Streptococcus.

Это грамположительные кокки, располагающиеся преимущественно в виде цепочек разной длины. S. dysgalactiae наиболее часто формирует длинные цепочки состоящие 6-10 фрагментов. При окраске по Циль-Нильсону видны кокки синего цвета, без капсул.

Бактерии формируют круглые с ровными краями, выпуклые с гладкой поверхностью (S-форма), полупрозрачные с сероватым оттенком колонии диаметром до 1,0 мм. На кровяном агаре рост возбудителя может сопровождаться образованием зоной неполного гемолиза (неполное обесцвечивание питательной среды, зона вокруг колоний зеленоватого цвета) - α-гемолиз, а также гемолиз может полностью отсутствовать.

Культуральные свойства

- неподвижный факультативный анаэроб, оптимальная температура роста (37,0±0,5)°С;

- на сердечно-мозговом агаре (далее по тексту - СМА) с добавлением сыворотки крови лошади в количестве 5% растет в виде мелких до 1 мм, серовато-прозрачных колоний с ровными краями;

- на агаре с кровью образует круглые прозрачные колонии с сероватым оттенком, без зоны просветления питательной среды - отсутствие гемолиза или окруженные зоной неполного просветления - α-гемолиза;

- на жидкой среде- сердечно-мозговой бульон (далее по тексту - СМБ) - дает придонный осадок с диффузным помутнением среды, который при встряхивании полностью разбивается.

Бактерии рода Streptococcus обладают зависимостью от наличия сыворотки крови лошади в питательной среде. Без сыворотки отмечен слабый рост на поверхности агаровой среды в виде напыления, видимый только при рассмотрении под лупой. Общепринятыми средами для выращивания стрептококков являются мясо-пептонный агар (МПА) и бульон (МПБ) с добавлением 5% дефибринированной крови барана и 1% глюкозы, рН 7,2-7,6.

Хорошо сохраняется при условии лиофильного высушивания с сахарозо-желатиновой средой, а также при быстром замораживании и хранении при - 40°С.

Биохимические свойства

При посеве на среды Гисса или коммерческую тест-систему API Strept проявляет следующие биохимические свойства, представленные в таблице 1, не продуцирует ацетонин; отсутствие ферментов: пирролидонариламидазы, α-галактозидазы, β-галактозидазы; наличие ферментов: β-глюкуронидызы, щелочной фосфатазы, лейцинаминопептидазы, аргинидегидролазы; отсутствие гидролиза гиппуровой кислоты и β-глюкозидзы; подкисление: рибозы, лактозы, трегалозы, амидона и отсутствие подкисления: маннит, инулин, рафинозы.

Антигенные свойства

При постановке реакции агглютинации (РА) с группоспецифическими сыворотками штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae по капсульному антигену принадлежит к серогруппе С.

Инактивированный штамм индуцирует выработку антител, выявляемые методами реакции агглютинации (РА) и иммуноферментным анализом (ИФА) и обладающих защитным действием против стрептококкоза.

Биотехнологические свойства

Оптимальными условиями культивирования штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae являются следующие:

- чашки Петри с питательными средами: сывороточный агар Колумбия, кровяной агар Колумбия; посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (37,0±0,5)°С;

- флаконы с жидкой питательной средой (сывороточный сердечно-мозговой бульон (СМБ)); посев инкубируют при температуре (37,0±0,5)°С в течение 18-24 ч.

Чистоту культуры проверяют методом световой микроскопии мазков, окрашенных по Граму.

По завершении культивирования агаровую культуру штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae смывают стерильным физиологическим раствором в объеме 5,0 см³ на одну чашку, определяют концентрацию бактериальной суспензии по оптическому стандарту мутности. По результатам визуальной стандартизации доводят концентрацию исходной бактериальной суспензии до 10⁹ м.к./см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae чувствителен к ампициллину с клавулановой кислотой, цефалоспоринам, гентамицину.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами в составе инактивированной вакцины не обладает. Иммунизация кроликов в удвоенной терапевтической дозе вакцины, в соответствии с ГОСТ 31926, не вызывает местной-раздражительной и воспалительной реакций после инъекции.

Патогенные свойства - штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae патогенен для белых мышей.

Вирулентность - высоковирулентен.

Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами - штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae не контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами.

Условия хранения.

При хранении штамма в нативном состоянии при температуре минус (70,0±5,0)°С допустимая длительность хранения без освежения составляет 12 мес., а при хранении в лиофилизированном состоянии при той же температуре - 10 лет.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Культивирование штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae, с целью получение антигена данного штамма.

Для культивирования штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae использовали питательную среду - сердечно-мозговой бульон с добавлением 5% сыворотки крови лошади.

Для получения бактериальной массы был использован ферментер «Biotron LiFlus GX», оснащенный системами регистрации и регулирования основных параметров культивирования: температуры, концентрации водородных ионов, скорости вращения мешалки и расхода кислорода для аэрации. Объем питательной среды в аппарате составлял 7,0 л с добавлением сыворотки крови лошади в количестве 0,35 л. Культивирование проводили в течение 24 часов при температуре (37,0±0,5)°C с постоянной подачей кислорода в количестве 1 л/ч.

Через 24 ч культивирования в бактериальную суспензию добавляли 0,2% формалина по объему. Инактивацию проводили 24 часа при непрерывном перемешивании (100 об/мин) и поддержании температуры в диапазоне 37,0-37,5°С. Для определения полноты инактивации через 24 часа после внесения формалина бактериальную суспензию высевали «газоном» в количестве 1,0 см³ на чашку Петри с сывороточным СМА. Инкубацию чашек Петри проводили в течение 48 часов при температуре (37,0±0,5)°С в условиях обычной атмосферы. При просмотре чашек Петри с сывороточным СМА рост культур бактерий S. dysgalactiae отсутствовал, что характеризовало положительное проведение инактивации.

Таким образом, получен инактивированный антигенный бактериальный материал из штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae, используемый для дальнейшей работы.

Пример 2. Определение патогенных свойств штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae проводили на белых мышах. Для заражения были использованы 18-20 часовые бульонные культуры стрептококка, выращенного на СМБ с добавлением 5% сыворотки крови лошади. В опыте использовали 10 белых мышей (5 голов на заражение и 5 голов контрольная группа). Культуру стрептококка вводили животным внутрибрюшинно в дозе 0,5 см³. Наблюдение за подопытными животными вели в течение 5 сут. Культуру признают патогенной при гибели не менее четырех белых мышей в группе. Для подтверждения специфической гибели белых мышей делали посевы на сывороточный СМА образцов материала из спинного мозга, крови, сердца, печени и селезенки.

В ходе установления специфичности гибели при проведении бактериологического исследования проб от всех павших животных была выделена чистая культура стрептококка.

Штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae патогенен для белых мышей. Вирулентность штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae - высокая. Летальность в группе составила 100% в течение 48 ч.

Пример 3. Определение стабильности штамма «SD-21» бактерий
S. dysgalactiae при хранении.

Для получения бактериальной массы штамм «SD-21» бактерий
S. dysgalactiae высевали на чашки Петри с сывороточным СМА. Посевы инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 24 ч. По завершению инкубирования агаровую культуру смывали стерильной сахарозо-желатозной средой (стабилизирующая среда) в объеме 5,0 см³ на одну чашку. Определяли концентрацию бактериальной суспензии по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей «ОРМЕТ». По результатам визуальной стандартизации доводили концентрацию исходной бактериальной суспензии до 10⁹ м.к./см³.

Бактериальную суспензию фасовали по 0,5 см³ в ампулы соответствующей вместимости.

Процесс лиофилизации после внесения стабилизаторов сушки включает стадии замораживания, высушивания, досушивания и запаивания ампул.

Замораживание: бактериальную суспензию перед лиофилизацией промораживали. Для этого устанавливали три датчика контроля температуры материала в процессе сушки. При достижении температуры в материале минус (60±1)°С его выдерживали при внешней температуре не выше минус (70±1)°С в течение 24 ч, после чего процесс замораживания бактериальной суспензии считали законченным. Холодильную камеру сублиматора перед постановкой кассет с замороженным материалом дезинфицировали 70%-ным этиловым спиртом и охлаждали до температуры не выше минус (50±1)°С.

Высушивание: замороженный материал незамедлительно перегружали в камеру сублиматора. Сублимационная установка перед загрузкой должна находиться в режиме:

- температура полок - минус (50±1)°С;

- температура конденсора - минус (60±1)°С;

- вакуум-насос - в рабочем состоянии, отключен.

После загрузки камеры подключали вмороженные в материал датчики контроля температуры, камеру герметизировали и вакуумировали до остаточного давления 80-90 мм рт.ст., проводили процесс высушивания согласно установленному режиму: температура конденсора - минус 50-80°С, вакуум в камере - 80-90 мм рт.ст., время сушки - до 48 ч.

Досушивание: проводили при температуре материала 24-27°С в течение 12-16 ч. Давление в камере не должно быть выше 90 мм рт.ст. Общее время сушки с досушиванием составляет 60-64 ч.

Запаивание ампул: после завершения процесса сублимационного высушивания камеру сублиматора через стерилизующий фильтр заполняли стерильным воздухом, открывали и ампулы с материалом быстро перекладывали в эксикатор с осушенным силикагелем. Ампулы с материалом запаивали незамедлительно в день разгрузки в условиях стерильного бокса.

Датой изготовления штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae считают дату проведения лиофилизации.

Штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae хранят в лиофилизированном виде в запаянных ампулах, упакованных в коробки из картона и металлические контейнеры, при температуре минус 40-70°С. Срок хранения штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae с даты лиофилизации составляет 5 лет.

По истечении 6 месяцев хранения проводили вскрытие 5 ампул с лиофилизированной культурой штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae и определяли физико-химические и биологические показатели штамма. Все показатели соответствовали требуемым нормам, т.е. штамм при хранении в течение 6 месяцев не изменил свои свойства.

Пример 4. Определение биохимических свойств штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae.

Биохимические свойства предлагаемого штамма определяли с помощью набора API Strep (BioMerieux) для идентификации бактерий семейства Streptococcaceae и родственных микроорганизмов по продукции ацетоина, гидролизу гиппуровой кислоты, гидролизу эскулина, продукции: пирролидонилариламидазы, α-галактозидазы, β-глюкуронидазы, щелочной фосфатазы, лейцинаминопептидазы, аргининдегидролазы, подкислению: D-рибозы, арабинозы, маннита, сорбита, лактозы, трегаллозы, инулина, рафиннозы, рафиннозы, амидона и гликогена.

В контейнер для инкубации (поднос и крышку) вносят 5 см³ очищенной воды для создания влажной атмосферы. Помещали стрип в контейнер для инкубации. В пробирку, содержащую 5 см³ стерильного физиологического раствора с помощью бактериологической петли вносили 2-3 изолированных колонии предлагаемого штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae и тщательно растирали в пробирке. Пипеткой распределяли суспензию по лункам стрипа, избегая образования пузырьков. Поднос накрывали крышкой и инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 18-24 ч.

Продукцию каталазы определяли в тесте с 3%-ным раствором перекиси водорода.

Биохимические свойства штамма представлены в таблице 1, которые соответствуют свойствам представленным в определителе Берджи. По результатам проведенных исследований штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae относится к роду Streptococcus, виду S. dysgalactiae.

Пример 5. Определение серогрупповой принадлежности штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae, по капсульному антигену проводили с помощью набора группоспецифических сывороток в реакции латексной агглютинации Pastorex Strep (BIORAD). Латексные частицы реагентов набора индивидуально сенсибилизированы кроличьими антителами, специфичными для одного из углеводных стрептококковых антигенов групп A, B, C, D, F, G.

Отбирали отдельные колонии штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae с питательной среды и ресуспендировали в ферментном растворе для экстракции антигенов. Экстракцию проводили в течение 15 мин при комнатной температуре. Готовый экстракт тестировали на реакционном слайде с шестью суспензиями латексных частиц, покрытых антителами, каждая из которых специфична для одной из групп стрептококков (A, B, C, D, F, G).

В присутствии гомологичного антигена латексные частицы суспензий агрегируют, давая видимую невооруженным глазом агглютинацию. Положительный контроль содержит инактивированные поливалентные экстракты для групп A, B, C, D, F, G стрептококков.

Результат теста (бихроматическое окрашивание) оценивали визуально через 1-2 мин. Проявилась красная агглютинация на зеленом фоне в пробирке с экстрактом группы С - что указывает на положительную реакцию. Штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae принадлежит к серогруппе С.

Пример 6. Определение агглютинирующей активности антигена штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae.

Полученные препараты антигена, как описано в примере 1, исследовали в реакции агглютинации (РА) микрометодом для выявления агглютинирующей активности антигена.

Принцип предлагаемого варианта реакции агглютинации на планшете микрометодом заключается в склеивании и выпадении в осадок антигенов S. dysgalactiae под действием специфических антител (агглютининов) в специфической сыворотке крови кролика в присутствии солей электролитов, что визуально регистрировали образованием четко оформленного зонтика на дне лунки планшета. При отрицательной реакции агглютинации антиген оседает на дно в виде точки.

Для постановки реакции использовали иммуноспецифические компоненты:

- специфическая сыворотка крови кролика, однократно иммунизированных антигеном бактерий S. dysgalactiae серогруппы С (положительный контроль);

- нормальная сыворотка крови кролика, не содержащая антител к S. dysgalactiae серогруппы С (отрицательный контроль);

- исследуемый антиген штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae (бактериальная суспензия, полученная методом культивирования в жидкой питательной среде, инактивированная формалином). Общую концентрацию микробных клеток в бактериальной суспензии определяют визуально по стандарту (эталону) мутности. Для постановки РА использовали инактивированный антиген из штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae с концентрацией микробных клеток 1×10⁹ в см³.

Для постановки РА готовили двукратные разведения антигена от 1:2 до 1:4096. Для этого во все лунки планшета вносили фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) - (рН 7,2-7,4) в объеме 0,05 см³. В первую лунку добавляли подготовленные пробы антигена штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae в объёме 0,05 см³, трехкратно пипетировали и переносили 0,05 см³ во вторую лунку и т.д. Из последней лунки после трехкратного пипетирования 0,05 см³ испытуемого материала удаляли в 2%-ый раствор едкого натрия или другой подобный дезинфектант.

Готовили рабочее разведение положительной и отрицательной контрольных сывороток (1:100) и вносили их во все лунки планшета с разведениями антигена в объёме 0,05 см³. Одновременно ставили контроли реакции:

- контроль антигена - в две лунки планшета вносили по 0,05 см³ ФСБР разведения антигена. Агглютинация антигена должна полностью отсутствовать;

- контроль сывороток на спонтанную агглютинацию - к 0,05 см³ контрольной сыворотки крови добавляли 0,05 см³ ФСБР. Спонтанная агглютинация сывороток должна отсутствовать.

Планшеты с компонентами реакции инкубировали в течение 18 часов при температуре (37±0,5)°С в статическом состоянии в шейкере-инкубаторе, затем выдерживали в бытовом холодильнике при температуре 4°С в течение 1 часа, после чего производили визуальный учет реакции.

Реакцию учитывали после полного оседания бактериальных клеток в лунках с контролем антигена.

Титром исследуемого антигена считали его наибольшее разведение, которое дает чёткую видимую агглютинацию («зонтик»).

Результат реакции считали положительным, если в лунке наблюдали четко выраженную агглютинацию в виде «зонтика», с титром в РА≥1:16 (4 log₂).

Результат считали отрицательным, если антиген оседал на дно лунки в виде точки («пуговки»), с титром в РА<1:16 (4 log₂).

Агглютинирующий титр бактериальной суспензии штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae составил 1:1024 (10 log₂).

Пример 7. Получение экспериментальной модели вакцины на основе антигена штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae.

В качестве антигена при изготовлении вакцины против мастита коров использовали бактериальную суспензию штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae, полученную по примеру 1.

Для получения клеточного антигена из бактериальной суспензии - использовали высокоскоростную проточную центрифугу BR 105BRLL, скорость подачи бактериальной суспензии составляла 1 л/час при вращении ротора 14000 об/мин. Общее время центрифугирования составило 15 мин. По окончанию работы ротор извлекали и перемещали в зону чистоты класса А.

Работу по стерильному извлечению бактериальной массы проводили в локальной чистой зоне 3W. Бактериальную массу снимали с внутренних стенок ротора центрифуги стерильным металлическим шпателем и погружали в стерильный стеклянный стакан. Предварительно в стакан был внесен стерильный фосфатно-солевой буферный раствор в объеме 0,05 л. После снятия всей бактериальной массы суспензию гомогенизировали в лабораторном гомогенизаторе Silverson L4R при комнатной температуре в течение 15 мин при частоте вращения мешалки 2500-2700 об/мин.

Полученную бактериальную суспензию фильтровали через стерильный многослойный марлевый фильтр в стерильную бутыль и определяли концентрацию клеток. При постоянном перемешивании бактериальную суспензию разбавляли стерильным фосфатно-буферным раствором до концентрации 1000 ОЕ/см³ (по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей «ОРМЕТ»). Готовую суспензию клеточного антигена из штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae до компоновки вакцины хранили в стеклянной бутыли под резиновой пробкой в комнате-рефрижераторе при температуре плюс 4-8°С. Перед перемещением на хранение антиген отбирали в количестве 5,0 см³ и проверяли на стерильность в соответствии с ГФ XIV, т.1, стр. 1201-1222 (ОФС.1.2.4.0003.15).

Для создания экспериментальной серии препарата в количестве 1,0 тыс. доз было использовано:

- инактивированный антиген из штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae в количестве - 0,02 дм³;

- стерильный физиологический раствор, в количестве - 0,48 дм³;

- адъювант Montanide ISA 206 VG, в количестве - 0,5 кг;

- тиомерсал, в количестве - 0,002 дм³.

С целью получения эмульсионного препарата, специфический иммуностимулятор (антиген) соединяли со стерильным физиологическим раствором, заявленное выше количество антигена сопоставимо с 2×10⁹ м.к./доза. Масло предварительно было перелито в стеклянную бутыль. Данный адъювант не пригоден для автоклавирования, поэтому перед эмульгированием подвергался холодной стерилизации через капсульный фильтр (0,22 мкм). Все компоненты вакцины были нагреты до 35,0°С. Адъювант соединяли с антигеном при низких оборотах мешалки (250 об/мин) в течение 15 мин. Для получения стабильной эмульсии полуфабрикат вакцины охлаждали до 12°С и проводили повторное эмульгирование в течение 15 мин.

Данной вакциной было иммунизировано 5 кроликов внутримышечно прививной дозой 1,0 см³. У кроликов до иммунизации и через 21 день после вакцинации были отобраны пробы сыворотки крови. Данные сыворотки проверили на наличие антител к бактериям штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae в РА и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Установлено, что через 21 сутки после однократной иммунизации кроликов инактивированной цельной вакциной, изготовленной из штамма «SD-21» бактерий S. dysgalactiae в сыворотке крови кроликов обнаружены антитела к S. dysgalactiae в ИФА в диапазоне титров от 8,64 до 10,64. log₂ (1:400-1:1600) и РА - 8 log₂ (1:256). Показано, что полученный штамм «SD-21» бактерий S. dysgalactiae обладает иммуногенными свойствами.

Таким образом, заявляемый штамм «SD-21» рода Streptococcus вида S. dysgalactiae может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм «SD-21» бактерий Streptococcus dysgalactiae для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров»:

1. Анюлис, Э.В. Изменение возбудителей субклинического мастита у коров при лечении антимаститными препаратами / Э.В. Анюлис, С. Япертас, Ю. Рудеевне, Р. Мишейкене //Матер. Межд. научно-практич конф., «Современные проблемы ветеринарного обеспечения репродуктивного здоровья животных» посвященной 100-летию В.А. Акатова. Воронеж, 2009. с. 49-53.

2. Балдина И.В. Оценка терапевтической эффективности разных схем лечения субклинического мастита в условиях молочно-товарной фермы // Молодежь и наука. №5. 2022.

3. Ивашкевич, О.П. Проблемы воспроизводства скота и маститов на промышленных комплексах / О.П. Ивашкевич // Ученые записки: сб. науч. тр. по материалам Межд. науч.-практич. конф. «Инновационное развитие ветеринарного акушерства, гинекологии и биотехнологии размножения животных в условиях интенсификации животноводства» 2-5 ноября 2011 года Витебск. Витебск, 2011. Т. 47. С. 53-55.

4. Авдуевская Н.Н. Золотистый стафилококк - один из главных возбудителей мастита лактирующих коров//Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2020. № 2 (34). с. 245-249.

5. Полянцев Н. И., Подберезный В. В. Ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных: учебное пособие. Ростов н/Д: Феникс; 2001. 480 с.

6. Кузьминский, И. И. Профилактика мастита у коров/И. И. Кузьминский, А. А. Богуш, В. Е. Иванов // Ветеринарное дело. 2015. № 2. С. 29-32.

7. Некрасов, Г. Д. Акушерство, гинекология и биотехника воспроизводства животных / Г. Д. Некрасов, И. А. Суманова. Барнаул: АГАУ, 2007. 204 с.

8. Argaw, Amare. Review on Epidemiology of Clinical and Subclinical Mastitis on Dairy Cows // Food Science and Quality Management 2016 Vol 52. P. 56-65.

9. Белкин Б.Л. Диагностика и нетрадиционные методы лечения субклинического мастита коров / Белкин Б.Л., Черепахина Л.А., Попкова Т.В., Скребнева Е.Н. // Вестник ОрелГАУ 1’06. 2020.

10. Белявский В.Н. Токсикологическая оценка и терапевтическая эффективность препарата "Цефолакт" при мастите и эндометрите у коров / Белявский В.Н., Лучко И.Т., Будько Ю.С. // Сборник научных трудов: Сельское хозяйство - проблемы и перспективы. Т. 48. 2020. с. 18-31.

11. Богуш, А.А. Терапевтическая эффективность противомаститного препарата фитодисульфан / А.А. Богуш [и др.] // Ветеринарная наука Минск, 2005. Т. 38. с. 127-128.

12. Климов, Н.Т. Экспериментальная и клиническая фармакология лекарственных препаратов на основе диоксидина и доксициклина и их эффективность при мастите у коров: Автореф. дисс. доктора вет. наук / Н.Т. Климов / Воронеж. 2009. 32 с.

13. Летунович, А.А. Разработка новых средств и способов диагностики, лечения и профилактики маститов у коров: автореф. дис. канд. вет. наук: 16. 00. 07 / А.А. Летунович; УО «Витебская ордена «Знак Почёта» государственная академия ветеринарной медицины». Витебск, 2006. 27 с.

14. Надточий, О.О. Этиопатогенез и разработка эффективного лечения мастита у коров и острых расстройств пищеварения у телят / О.О. Надточий // Эффективность ветеринарных мероприятий в промышленном животноводстве Кубани. Краснодар: КСХИ. - 1989. - с. 20-25.

15. Париков, В.А. Маститы у коров (профилактика и лечение) / В.А. Париков, Н.Т. Климов, А.И. Романенко и [др] // Ветеринария. - 2000. № 11. с. 34-37.

16. Горлов, И.Ф. Комплексное лечение коров при маститах / И.Ф.Горлов, О.С. Юрина, М.И. Сложенкина // Ветеринария. 2008. № 2. с. 37-39.

17. Ковальчук, С.Н. Маститы у коров (этиология, профилактика, лечение). Автореферат дисс. кандидата вет. наук / С.Н. Ковальчук. Витебск. 2006. 18 с.

18. Филиппова, О.В. Эффективность нетрадиционных способов лечения маститов у коров / О. Филиппова [и др.] // Молочное и мясное скотоводство. 2001. № 7. с. 26-29.

19. Ходаков, А.В. Эффективность различных препаратов при лечении скрытого мастита у коров / А.В. Ходаков // Диагностика и терапия незаразных болезней с- х. животных: Сб. науч. работ. Воронеж, 1986. с. 23-25.

20. Vaarst, M. Patterns of clinical mastitis manifestation in Danish organic dairy herds. / M. Vaarst, C. Eneroedsen // v. Dairy Res. 1997. V. 64. № 1. Р. 23-27.

21. Авдуевская Н.Н. Сравнительный анализ видового состава и количественное соотношение микрофлоры при субклиническом и клиническом мастите коров / Авдуевская Н.Н. и др. // Ветеринария сегодня, Владимир, 2022. с. 296-302.

22. Галкин А.В. О выявлении возбудителей мастита и их чувствительности к антибиотикам / Галкин А.В., Трепалина Е. // Эффективное животноводство. 2017. № 7 (137). с. 22-23.

23. Патент US 8 986 973 B2, 26.03.2014 г.

24. Патент RU 2 761 379 C1, 23.04.2021 г.

25. Патент CN 109 519 768 А, от 22.01.2022 г.

26. Патент RU 2 662 300 C2, от 10.02.2010 г.

27. Патент RU 2 762 088 C1, от 05.05.2021 г.

28. Патент RU 2 787 754 C1, от 20.07.2022 г.

29. Патент WO 01/96381 А2, от 20.12.2001 г.

Таблица 1

Биохимические свойства штамма S. dysgalactiae «SD-21»

(предлагаемое изобретение)

Тест (показатели) Штамм «SD-21» Streptococcus dysgalactiae (предлагаемое изобретение) по определителю Берджи Продукция ацетонина - - Наличие ферментов: пирролидонариламидаза - - α-галактозидаза - - β-галактозидаза - - β-глюкуронидаза + + Щелочная фосфатаза + + Лейцинаминопептидаза + + Аргининдегидролаза + + Гидролиз: Гиппуровой кислоты - - β-глюкозидазы - - Подкисление: Рибозы + + Лактозы + + Трегалозы + + Амидона + + Маннита - - Инулина - - Рафинозы - - Примечание: «+» - положительный результат,
«-» - отрицательный результат.

Таблица 2

Результаты исследований проб сывороток крови кроликов на наличие антител в непрямом варианте ИФА и РА к штамму «SD-21» бактерий Streptococcus dysgalactiae

Характеристика сыворотки крови Результат РА* Результат в непрямом варианте ИФА Совпадение результатов
+/- 1 повторность 2 повторность Нормальная сыворотка крови кроликов (до иммунизации) 1:50-отриц. 1:200-отриц 1:200-отриц + 1:50-отриц. 1:200-отриц 1:200-отриц + 1:50-отриц. 1:200-отриц 1:200-отриц + 1:50-отриц. 1:200-отриц 1:200-отриц + 1:50-отриц. 1:200-отриц 1:200-отриц + Сыворотки крови кроликов - 21 день после иммунизации 1:256-полож. 1:800-полож. 1:800-полож. + 1:256-полож. 1:1600-полож. 1:1600-полож. + 1:256-полож. 1:1600-полож. 1:1600-полож. + 1:256-полож. 1:800-полож. 1:800-полож. + 1:256-полож. 1:400-полож. 1:400-полож. + Гетерологичные сыворотки крови кроликов, содержащие антитела к возбудителю: Pasteurella multocida отриц. отриц. отриц. + Staphylococcus aureus отриц. отриц. отриц. +

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарной микробиологии, в частности к новому штамму «SD-21» бактерий семейства Streptococcасеае рода Streptococcus вида Streptococcus dysgalactiae, депонированному в Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №389 - деп / 22-23- ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Предложенный штамм культивируется на питательных средах - сердечно-мозговой агар и сердечно-мозговой бульон, штамм обладает выраженными свойствами, характерными для своего вида, по серогрупповой дифференциации относится к серогруппе С, является высоковирулентным, а также обладает антигенными и иммуногенными свойствами. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров. 2 табл., 7 пр.

Штамм «SD-21» бактерий Streptococcus dysgalactiae, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №389 - деп / 22-23- ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров.