Способ диагностики протейной инфекции Советский патент 1982 года по МПК A61B10/00 

() СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПРОТЕЙНОЙ ИНФЕКЦИИ

I

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике заболеваний протейной этиологии.

Известен способ диагностики протейной инфекции ггутем проведения иммунологической реакции между специфическим антигеном и исследуемой сывороткой с последующим учетом результатов реакции 1 .

Однако известный способ недостаточно чувствителен из-за характера антигенного материала, непригодного для комплексной серодиагностики и обладакмдего ограниченным антигенным спектром, что снижает эффективность диагностики протейной инфекции.

Цель изобретения - повышение чувствительности способа.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа диагностики протейной инфекции путем проведения иммунологической реакции между специфическим антигеном и исследуемой сывороткой с последующим учетом результатов реакции, в качестве антигена используют поливалентный препарат, содержаций О- и Н-антигенные компоненты штаммов 03:Н1, Об:НЗ, 02б:Н2, 030:-Н, и при выявлении титров специфических антител в РОК 1:10 и выше, а в РПГА 1:80 и выше диагносцируют протейную инфекцию.

Способ осуществляется следующим образом.

10

У больного на 2- день и на 7 10 день от начала заболевания забирают кровь и готовят сыворотку, как обычно, которую исследуют в реакции связывания комплемента (РСК) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). В качестве антигенного материала в РСК применяют раствор поливалентного препарата из расчета 1 мг лиофилизированного антигена на Змл фи20зиологического раствора. Для постановки РПГА готовят диагностикум из свежих или формалинизированных эритроцитов барана,, танизированных и сен390сибилизированных поливалентным антигеном из расчета 0,0+-0,05 мг антигена на 1 мл 1,,0 взвеси эритроцитов в фосфатном растворе рИ 6,4. Поливалентный препарат готовят в условиях производства или лаборатории следующим образом, В качестве сырья для приготовления антигенного препарата используют высоко подвижные культуры Proteus mlrabills, принадлежащие к серотипам 03:Н1, Об;НЗ, ОЗОУН и 026 :Н2. При подобном подборе, штаммов продуцентов, включенные В препарат Н-антигены, позволяют регистрировать Н-антитела к k2 серотипам протеев (23 различным серогруппам) из 52 серотипов, вообще выделяемых при заболеваниях у людей, что составляет 81,0. В то же время вклю ченные в препарат 0-антигенных компо нентов наиболее важных этилогически 0-серогрупп гарантирует регистрацию иммунного ответа в случае инфицирования неподвижными вариантами протее Бактериальную массу каждого из t-x штаммов выращивают на свежеприготовленном 1%-ом мясопептонном агаре при 22°С в течение 72 ч, что обеспечивает максимальное развитие жгутико вых антигенов. Массу смывают с питательной среды, промывают физ)зологическим раствором, центрифугируя при 5-6 тыс. об/мин в течение 30 мин. Го товят взвесь клеток в дистиллированной воде из расчета 50 мг влажной массы в 1 мл. Взвесь подвергают ульт развуковой обработке при 12-15 С в аппарате при частоте 800-1000 кГц, мощности 5-10 Вт в течение 10-20 мин Щадящая обработка ультразвуком позволяет одновременно извлекать в жидкую фазу минимально травмированные О- и Н-антигенные компоненты и обеспечивает необходимое и примерно равное их количество в препарате. Озвученную взвесь центрифугируют при 7-9 тыс. об/мин в течение 30 мин для удаления неразрушенных клеток и их обломков при 4 С. Полученные из k-x. штаммов экстракты соединяют в ра НЫХ объемах, перемешивают и лиофилиз руют в сублимационной установке при подогреве препарата до 38 С в течение 48 ч. Учет результатов РСК и РПГ производят через 1 ч после окончания реакции. Уровень антител в сыворотке в РСК-1:10 и выше, а в РПГА - 1:8 и .выше указывает на наличие у больного протонной инфекции. Пример. Исследуют сыворотку крови больного Н. с клиническим диагнозом хронический пиелонефрит (из мочи выделяют культуры Proteus mirabilis и Escherichia coli) и больного М. с диагнозом гастроэнтерит невыясненной этиологии, взятые на 1-й и день заболевания. Все 3 сыворотки инактиаировали 1 ч при 60°С на водяной бане в разведении 1:5 стерильным физиологическим раствором и исследовали в РСК и РПГА с поливалентным протейным антигеном. Для РСК.готовят разведения каждой сыворотки i :5,l: Ю, 1:20, и 1:80 в физиологическом растворе в объеме 0,2 мл. В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл антигена в рабочем разведении (1 мг и 3 мл физиологического раствора) .и по 0,2 мл раствора комлемента в рабочей дозе. После тщательного перемешивания и экспозиции в термостате 1 ч при в каждую пробирку добавляют по 0, мл гемолитической смеси (выдержанной 30 мин при смеси равных объемов 3% взвеси бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки в рабочем титре), помещают на 30 мин в термостат при 37 С. Реакцию сопровождают контролями сыворотки больного, антигена и комплемента. За положительную реакцию принимают задержку гемолизана креста. Учет реакции производят через 1 ч после окончания экспозиции. Для РПГА сыворотку адсорбируют эритроцитарной массой (2 объема сыворотки к 1 объему эритроцитов) при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем готовят ряд разведений сыворотки (по 0,4 мл) в пробирках или пластинках с лунками 1:40, 1:80, 1:1бО, 1:320 и более раствором нормальной сыворотки кролика в физиологическом растворе. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1, взвеси танизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных антигенными препаратами (сенсибилизирующая доза 0,04-0,05 мг/мл), перемешивают и оставляют при комнатной; температуре. Реакцию сопровождают контролями: сыворотки больного с несенсибилизированными эритроцитами) и диагностикума (с нормальной кроличьей сывороткой) .За положительную реакцию принимают наличие гемагглютинации зонтик на креста. Для получения поливалентного антигенного препарата 5 г бактериальной массы каждого 590 из -х выращенных на свежеприготовленном 1%-ом МПА в течение 72 ч при 22 С промывают один раз 60 мл физиологического раствора, центрифугируют в течение 30 мин при 6000 об/мин, Готовят 100 мл взвеси отмытых клеток в дистиллированной воде из расчета 50 мл влажной массы на 1 мл, смесь подвергают ультразвуковой обработке при частоте кГц в течение 3-5 мин. Озвученную взвесь центрифугируют при 8000 об/мин в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость, опалесцирующую, свободную по данным бактериологического и микроскопического контролей от неразрушен ных клеток, соединяют с равными объе мами приготовленных таким же способом экстрактов ЗХ других штаммов. Объединенный экстракт разливают в стерильные флаконы и лиофилизируют на сублимационный установке при подогреве препарата до 38 С в дечение 8 Получают 850 мг препарата, что соетавляет 21,5 от веса сухой биомассы Препарат содержит 55,0% белка, 12,2% Сахаров, 13,5 влаги и 12,0% зольных элементов. Антигенный спектр препарата определяют в РСК и РПГА с адсорбированными агглютинирующими О- и И- зо антисыворотками Московского НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова. Положительные реакции с соответствую щими 0-сыворотками в РСК в титрах 1:3 -1:6i, а в РПГА - 1:16-1:32 и с Н-сыворотками, соответственно, 1:321:6 и 1:6А-1:25б указывают на лрисутствие в препарате Н- и 0-антигенных конлонентов каждого исходного штамма примерно в равных количествах или с превалированием Н-антигена. Ис .пытания серологической активности препарата показали, что рабочая доза поливалентного препарата в РСК и РПГ (с танизированными эритроцитами)соетавляет 0,25-0,30 мг/мл и 0,0 0,05 мг/мл соответственно. При этом иммунных кроличьих сыворотках в РСК выявляют титры антител 1:320-1:6 0, в РПГА 1:20 80-1: 0960. Полученный лиофилизированный препарат сохраняе антигенную активность при С на про тяжении 2-х и более лет (срок наблюдения) .Учет результатов выявления специфических протейных антител в исследо ванных 3-х сыворотках показал следующе 1) Сыворотка больного Н, РСК положительна в титре , РПГА положительна в титре 1:80 3 2)Сыворотка больного М. РСК отрицательна- в титре 1:5 (на 1-й день заболевания) РПГА положительна в титре 1:20 3)Сыворотка больного М. РСК положительна в титре 1:5 (на 8-й день заболевания)РПГА положительна в титре 1:80 У больного Н. выявлены специфические антитела в РСК в титре, превышающим диагностический (1:10), и в РПГА в титре диагностическом, следовательно, в данном случае имеет место хронический пиелонефрит протейной этиологии и показано применение соответствующей иммуно- и антибиотикотерапии. У больного М, при отсутствии бактериологического подтверждения, а значит при невозможности установления этиологического диагноза известным способом в реакции агглютинации с аутоштаммом в сыворотке, взятой на 8-1 день заболевания, выявлены противопротейные антитела в РСК титре 1:5 (ниже диагностического)и в РПГА - 1:1бО (диагностической титр). Учитывая результаты и факт нарастания титра антител в РПГА в Ц раза по сравнению с 1-м днем заболевания, в данном случае также ставят диагноз острого гастроэнтерита протейной этиологии. Предлагаемый способ применен при диагностике протейной инфекции 97 сы-вороток детей с острыми кишечными заболеваниями различной этиологии. Параллельно сыворотки 12 детей, выделявших протей, испытывали в реакции агглютинации с аутоштаммами. Оказалось, что у детей, не выделявших Рго-teus mirabllis, РСК была отрицательной, а РПГА - положительной в титрах 1:10-1:20, т.е. ниже диагностического значения, у 5 детей из 78, составило 6,2%. В то же время из детей выделявших протей двухили трехкратно (1 человек) предлагаемым способом удалось поставить диагноз протейной инфекции у 8 детей (диагностический титр в РСК 1:10 1:20 у 3 и в РПГА 1:80-1:60 - у 7), в то же время с помощью реакции ai- глютинации с аутоштаммом удалось поставить диагноз протейной инфекции лишь у 3 детей из 11, повторно выделявших протей (диагностические титры антител 1:80-1:1бО). Таким образом предлагаемый способ обладает большей чувствительностью по сравнению с известным способом в 1,8 раза для урологических и в Z, раза для кишечных заболеваний, специфичен упрощает этиологическую диагностику протейной инфекции,делает диагностику возможной независимо от периодичности выделения возбудителя и культуральноАнтигенных свойств выделенных штаммов и дает более достоверные рёэультаты, благодаря возможности одновременного применения двух серологических тестов. Формула изобретения . Способ диагностики протейной инфекции путем проведения иммунологической реакции мемщУ специфическим антигеном и исследуемой сывороткой с последующим учетом результатов реакции, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствитель1ности способа, в качестве антигена используют поливалентный препарат, содержащий О- и Ji-а тигенные компоненты штаммов , Об:ИЗ, 026:Н2, 020:Н4, и при выявлении титров спе цифических антител в РСК 1:10 и выше, а в РПГА 1:80 и выше диагносцируют протейную инфекцию. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Витвицкий В.М.Значение бактериологических и серологических исследований при протейных инфекциях. Врачебное дело, 1975,, №3, с.1391 4,