Изобретение относится к микробиологической промышленности и представляет собой штамм Azotobacter chroo- coccum для получения бактериального удобрения под томаты.
Целью изобретения является полу- чейие нового штамма Azotobacter chroococcum для производства бактериального удобрения, специфически по- IQ матографе.
вышающего урожай томатов.
Штамм получен путем селекции одновременно на комплекс положительных признаков - сродство (способность прочно прикрепляться) к поверхности корней томатов, размножение на корнях в присутствии определенной почвы, конкурентоспособность с ее естественной микрофлорой. Методика селекции заключалась в многоступенчатом отборе клеток азотобактера, прочно связанных с поверхностью корней томатов после длительного выращивания обработанных большим количеством клеток исходного штамма азотобактера проростков томатов в нестерильной почве. Для исключения случаев отбора природных клеток азотобактера (как это случалось при использовании из- вёстных методов селекции) в исходную культуру клеток вводилась генетичес- .кая метка. Клоны, отобранные с поверхности корней и способные при по- следуюш;ей обработке колонизировать корневую систему (показывать сплошное обрастание корней), отличались от исходного штамма-Прототипа наличием и повьш1енньм синтезом определенных экзобелков, обнаруживаемых при гель-эктрофорезе.
Специализированный штамм селекционировался затем на способность размножаться в торфяной среде - субстрате для получения бактериального удобрения.
Полученный штамм назван авторами Azotobacter chroococcum Т-12 и депонирован в Центральном Музее промьш - ленных микроорганизмов ВНИИгенетики под № В-3344.
Штамм Azotobacter chroococcum ЦМПМ В-3344 имеет следующие характеристики.
Культурально-морфологические особенности штамма. Крупная короткая палочка с закругленными концами, имеются жгутики, протоплазма у молодых клекток гомогенная и блестящая. Клетка одета капсулой. Покоящаяся
форма - циста. Молодая культура бесцветна, старая - коричневая.
Продукт, синтезируемый штаммом. Гетероауксин, витамины группы В, гиббереллины, фиксирует молекулярньй азот.
Азотфиксирующая активность определяется ацетиленовым методом на хроСпособ, условия и состав среды для хранения штамма. На косяках ага- ризованной среды Burk под минераль- ньм маслом при 5°С 1 год. Состав
среды Burk на 1 л: 0,64, г; , 0,16 г; MgSO 0,2 г; NaCl 0,2 г| CaS04 2H20 0,05 г; 1 мг; FeSO 3 мг; сахароза 20 г. Способ, условия и состав сред для размножения штамма. Поверхность агаризованной среды Burk, t 28 c.
Условия и состав сред для ферментации. Аэрация. I
Состав питательной среды для культивирования штамма в ферментере приведен в табл. 1.
Таблица 1
Сахар пищевой
KgHPO
КН jpPO
MgSO.
NaCl
CaSO
50
FeSO
55
Дрожжевой экстракт
Пеногаситель (олеиновая к-та)
1
Продолжение табл.1 12I 3
Г
1359272
ни были извлечены из почвы, отмыты - от нее и разложены на поверхности
агаризованной среды Бэрка. Через . 48 ч корни были по всей длине покрыты колониями штамма ЩШМ В-3344. Прибавка урожая Б опыте составила 37,2%, Средний вес одного зрелого плода в контроле 54,75 г, в опыте
рН 6,8-7,0 доводится 20%-ным раст-10 70,06 г.
вором NaOH или разбавленной НС1 Пример. Штамм размножают на
агаризованной среде Бэрка, вносят в
почву теплицы с добавлением в нее j
мела 5 г/кг, 0,4 г/кг, этилоСвойство штамма Azotobacter chroo- 15 вого спирта 6 мл/кг и подращивают
Вода водопроводная, л
1
19,5
coccum ЦМПМ В-3344 - прикрепляться к корням томатов и в результате этого повышать их урожай стабильно.
Стабильность штамма проверялась путем испытания его в производствен- ных условиях. Штамм, прошедший более 70 пересевов на агаризованную среду Бэрка и 5 месячное культивирование в торфе, был внесен под культуру томат сорта Русич. Через 117 дней после бактеризации сеянцев томатов их корВлияние бактериального удобрения на основе штамма Azotobacter
chroococcum ЦМПМ В-3344 на томаты.
Технология заводского приготовления препарата.
Штамм ЦМПМ В-3344 выращивают в ферментере на модифицированной среде Бэрка (состав среды приведен в табл 3) с аэрацией до концентрации 10 кл/мл и культуральную жидкость инокулируют в полиэтиленовые пакеты с простерилизованным гамма-лучами в дозе 2-10 г измельченным торфом. Соотношение массы инокулята и торфа 1:3. После доращивания в термостате (при ) в течение 3 сут удобрение готово к использованию.
2 сут при 30 С в герметичных полиэтиленовых мешках (по 0,5 кг препарата в каждом), наполненных воздухом. Количество азотобактера в 1 г препарата 10 -10 клеток.. Препарат вносят в корневую систему растений томата при высадке- их в грунт теплицы. Контролем служат растения, не. обработанные препаратом.
Сравнительные данные приведены в табл. 2.
Т -а блица 2
Известные штаммы Azotobacter chroococcum не живут на поверхности корней и не формируют симбиотических ассоциаций с растениями. Их полезное
действие проявляется, например, на томатах в кратковременной ростости- муляции, что ведет к повьш1ению урожаев лишь при первых сборах плодов. Колонизация корней томата после
инокуляции почвы штамм-прототипом К и штаммом ЦМПМ В-3344 исследовалась методом обрастания. Через 18 дней после инокуляции корни томатов отмывали от почвы, взвешивали и раскладывали на поверхность агаризован- ной среды Бэрка. Через 3 сут определяли обрастание корней. В контроле после обработки штаммом К-прототипом обнаружена одна колония штамма-прототипа на 1 г корней. В опыте после обработки предлагаемом штаммом наблюдали.сплошное обрастание корней клетками этого штамма.
ТаблицаЗ Состай модифицированной среды Бэрка
Вода водопроводная, л
19.5
рН 6,8-7,0 доводится 20%-ным раствором NaOH или разбавленной НС1
Сравнительное исследование влияния обработки культуры томата клетками прототипа (штамма К) и штамма ЦМПМ В-3344 на рост биомассы томата.
Корни рассады томата при пикировке обмакивают в звесь с одинаковой концентрацией клеток штамма К (контроль) и специализированного штамма (опыт) и высаживают в почву. Через 18 дней
вегетации определяют массу надземной части растений. Масса в опыте превысила массу в контроле на 20,7%. При высадке рассады томата после обработки бактериями в песок, преимущества в действии специализированного штамма над штаммом-прототипом еще более значительны: масса надземной части растений увеличивается на 28%, а масса, корней на 79%. Эти данные сведены в табл. 4.
Таблица 4
Влияние суспензии клеток Azo- tobacter chpoococcum на при- . рост биомассы томатов.
5
0
5
ней клетками штамма ЦМПМ В-3344, в то время как в контроле наблюдались лишь единичные колонии штамма К.
Штамм увеличивает продолжительность полезного действия бактериального удобрения за счет большего времени функционирования в корневой системе. Исследование кинетики прибавки урожая томатов в производственных условиях показало, что после обработки рассады прибавка сохраняется на протяжении всех 11 сборов в течение 1,5 мес, в то же время при обработке природными штаммами, в том числе штаммом К, прибавка урожая наблюдается только в первых сборах.
Это показано в табл. 5 и 6.
Результаты производственных испытаний влияния обработки корней рассады томатов сорта Реанте бактериальным удобрением на основе штамма ЦМПМ В-3344 на урожай.
Контрольный участок (250 мО
Обработка удобрением
336
Динамика сбора плодов томатов в грунтовой таблице после обработки рассады бактериальным удобрением на основе штамма ЦМПМ В-3344 в сравнении с прототипом, 1984-1985 гг.
Штамм К
0,4
0,7 0,71
Штамм ЦМПМ
Как видно из таблицы, применение удобрения на торфяной основе дало прибавку урожая в 1,5 кг плодов с каждого м опытной делянки, или в среднем на 21,8%.
Как видно из таблицы, прибавка урожая по сравнению с прототипом сохр анилась на протяжении всего периода сбора урожая.
Преимущество штамма Azotobacter chroococcum В-3344 над К (этого же вида) особенно четко проявляется пр изменении почвенных условий. Так, ппытка применения штамма К для повышения урожая томатов в грунтовой теплице ИФ и БР АН Таджикской ССР
Таблица 5
587
461
191
1761
Таблица 6
0,73 0,4 2,94
оказалась безуспешной, тогда как применение варианта специализированного штамма ЦМПМ В-3344, селекционированного для культуры томата сорта Юрмалас, выращенного в данной почве, повысило урожай этого сорта тома- та на 40,9% на опытной площади 1000 м и урожай сорта Майкопский урожайный на 29% на площади 5000 м.
Это преимущество штамма ЦМПМ В-3344 объясняется его приживаемостью в данной почве и ингибирующим действием почвы на штамм К. Вывод иллюстрируется опытом: в стерильную вытяжку из почвы грунтовой теплицы ИФ и БР АН Таджикской ССР вносят
суспензию клеток варианта штамма ЦМПМ В-3344 (опыт) и штамма К (контроль) в концентрации 10 кл/мл, инкубируют при 28° С 4 сут с ежедневным измерением концентрации клеток . во взвеси, В опыте во взвеси через
О
2 сут обнаружено 10 кл/мл штамма ЦМПМ В-3344. Роста культуры в контроле не наблюдается даже через 4 сут. Использование предлагаемого специализированного штамма позволило получить торфяное удобрение с большим по сравнению с прототипом (по135927210
среды. Таким образом, сохранность клеток специализированного штамма в торфяном удобрении выше, чем клеток штамма-прототипа.
Предложенный штамм специфически повышает урожай томатов. Штаммы, специфичные к другим раст ениям, например штамм Т-9, специфичный к ячме10 ню, не оказывают такого эффекта.
Приме Р.Семена томатов сорта Русич замачивали в суспензии торфяных препаратов штаммов ЦМПМ В-3344,Т9 и К с
рядка Ю кл/г) титром жизнеспособных 15 равной концентрацией жизнеспособных
клеток, высевали в грунт и помеш;али под светоустановку. Через 25 сут взвешивали надземную часть растений. Опыт проводили двукратно в трех по- вторностях по 10 семян в каждом варианте. Средние результаты приведены в табл. 7.
20
клеток и дольшей стабильностью при хранении.
Способность клеток штаммов расти и сохраняться в торфяной среде (торфяной порошок с добавлением извести до и компонентов питания вместе с культуральной жидкостью при инокуляции) исследовалась по рравнению с известным штаммом. С этой целью двухнедельную агаровую культуру штамма К 25 смешивали со стерильным торфом, содержащим компоненты питательной среды, до начальной концентрации 10 кл/мл и хранили 2 мес при комнатной температуре, периодически определяя титр (количество) жизнеспособных клеток. Через 8 дней титр упал на 2 порядка, через следующие 10 дней - еще в 120 раз. Через 2 мес инкубации жизнеспособные клетки не обнаруживались. Торфяной препарат специализированного штамма ЦМПМ В-3344 готовили путем инъекции культуральной жидкости в концентрации 10 кл/мл в торфяную среду в соотно- 40 к штамму Т9, % шении торф: культуральная жидкость,
равном 3:1.. Через 2 сут хранения
при комнатной температуре в препарате обнаружено 5,410 кл/г, еще через сутки - 5,6-10 кл/г. Следова- 45
Таблица 7
Влияние обработки семян томата штаммами ЦМПМ В-3344, Т9 и К на .урожай биомассы проростков.
По отношению
100 142
92
Формула изобретения
тельно, штамм ЦМПМ В-3344 обладает способностью к доращиванию на торфяной среде. Через 2 мес хранения титр составил порядка 10 кл/г торфяной
Составитель Л. Борисова Редактор Н. Горват Техред М.Моргентал Корректор А. Ильин
Заказ 6111/24 Тираж 408Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
10 ню, не оказывают такого эффекта.
Приме Р.Семена томатов сорта Русич замачивали в суспензии торфяных препаратов штаммов ЦМПМ В-3344,Т9 и К с
тамму Т9, %
Таблица 7
Влияние обработки семян томата штаммами ЦМПМ В-3344, Т9 и К на .урожай биомассы проростков.
к штамму Т9,
По отношению
100 142
92
Формула изобретения
Штамм Azotobacter chroococcum ЦМПМ ВНИИ-генетика В-3344 для получения бактериального удобрения под томаты.
Изобретение относится к микробиологической промышленности. Оно представляет собой штамм несимбиоти- ческого азот-фиксатора Azotobacter chroococcum ЦМПМ В-3344, способный специфически прикрепляться к корням томатов и вступать с томатами в ассоциативный симбиоз. Бактериальное удобрение с торфяным наполнителем, полученное на основе этого штамма, повышает урожай томатов на 29% и обладает долговременным действием. Штамм характеризуется повьш1енной выживаемостью клеток в торфяной среде. 7 табл. i (Л оо сд со ю to
