ШТАММ БАКТЕРИЙ AZOTOBACTER CHROOCOCCUM ЗАО "БИОФЛОРА" N B-05 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПОЧВЕННОГО ПЛОДОРОДИЯ, ПОВЫШЕНИЯ УРОЖАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР И КАЧЕСТВА ЕГО, ОЗДОРОВЛЕНИЯ ПОЧВЫ, ВОССТАНОВЛЕНИЯ НАРУШЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ И БИОПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПОЧВЕННОГО ПЛОДОРОДИЯ И ВОССТАНОВЛЕНИЯ НАРУШЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ Российский патент 2001 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/65 

Изобретение относится к экологии, биотехнологии, сельскохозяйственной микробиологии, в частности к селекции микроорганизмов и получению на их основе биопрепаратов для повышения почвенного плодородия, оздоровления почвы и восстановления (ремедиации) нарушенных земель.

Известны штаммы Azotobacter chroococcum, значительно отличающиеся по своим свойствам. Например, штамм ВКПМ-6011 (1) повышает урожайность амаранта, снижает уровень нитратного азота, хорошо приживается в прикорневой зоне растений; штамм 92 (2) обладает способностью подавлять рост фитопатогенных грибов; штамм 6010 (3) эффективен только под зеленные культуры.

Недостатком штамма 92 является сравнительно невысокая продуктивность, а штаммы 6011 и 6010 оказываются эффективными только в прикорневой зоне определенного растения-хозяина.

Целью настоящего изобретения является получение штамма, обладающего высокой продуктивностью и приживаемостью в почвогрунте, а также широким спектром подавления патогенной микрофлоры, т.е. оздоравливающим эффектом наряду с достаточной нитрогеназной активностью. Продуктивность штамма должна быть достаточно высока с тем, чтобы производство препарата на его основе, равно как и расход на единицу обрабатываемой площади, были достаточно экономичны.

Штамм Azotobacter chroococcum 2E-16 (ЗАО "Биофлора"), коллекционный N B-05), выделен из окультуренной подзолистой почвы Сосновского района Челябинской области и отобран методом аналитической селекции из изолята по признакам: высокая продуктивность (в том числе на производственных, регламентных средах), высокая приживаемость в почвогрунте, широкий спектр подавления фитопатогенной микрофлоры, высокая нитрогеназная активность, высокий уровень синтеза ИУК. Штамм хранится и поддерживается в музее культур ЗАО "Биофлора", имеет коллекционный номер B-05.

1. Культурально-морфологические признаки.

1.1. На агаризованной питательной среде, имеющей состав, г/л: KH₂PO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; CaCO₃ - 5,0; сахароза - 20,0; агар - 20,0; смесь микроэлементов - 1 мл; дистиллированная вода - до 1000 мл, pH 6,8-7,0. Культура образует круглые колонии 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, кремовые или светло-коричневого цвета, с гладкими краями, мягкой тягучей консистенции. На 24 часу роста клетки - мелкие палочки, кокковидные; на 48 часу - 60 часу - кокковидные капсулированные, 1 х 12 мкм.

1.2. На твердой питательной среде Берка, имеющей состав, г/л: K₂HPO₄ - 0,8; KH₂PO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,2; NaCl - 0,2; CaSO₄ - 0,1; Fe₂(MoO₄) - 0,01; глюкоза - 10,0; дистиллированная вода - до 1000 мл, агар-агар - 20,0; pH 6,8-7,0. Культура образует круглые колонии 2-3 мм, с гладкой блестящей поверхностью, выпуклые, прозрачные, бесцветные, с гладкими ровными краями, однородной структуры. На 24 часу роста - очень мелкие палочки, подвижные, размер до 2 мкм. После 24 часа роста - клетки неподвижные, кокковидные, крупные 1 х 15 мкм.

1.3. На твердой питательной среде с бензойнокислым Na в качестве единственного источника углерода роста нет.

1.4. На жидкой питательной среде Федорова с мелассой, имеющей состав, г/л: K₂HPO₄ - 0,3; CaHPO₄ - 0,2; MgSO₄ - 0,3; K₂SO₄ - 0,2; NaCl - 0,5; FeCl₃ - 0,01; CaCO₃ - 5,0; меласса - 40,0; смесь микроэлементов - 1 мл; pH 6,8-7,0, выращивание при температуре плюс 28±1^oC и режиме аэрации - перемешивания 180-200 об•мин^-1 в течение 60 часов. Интервал естественного изменения pH 6,8-7,4. При микроскопировании на 24 часу культивирования - мелкие палочковидные клетки, слабоподвижные, 2-3 мкм, в слизистом окружении, отчетливо наблюдаемом при микроскопировании (негативный контраст); реакция по Граму в течение 18-24 часа - варьирует. Зрелые клетки на 60 часу ферментации - кокковидные, неподвижные, образуют толстостенные цисты; в зависимости от источника углерода может образовывать коричневый (от светло-коричневого до темного) водонерастворимый пигмент; реакция по Граму - отрицательная.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Штамм Az. chroococcum 26-16 - аэроб, оптимальная температура роста плюс (28±1)^oC.

Отношение к источникам углерода: очень хорошо усваивает глюкозу, фруктозу, часто с образованием пигмента, сахарозу, сорбит; хорошо усваивает маннит, глицерин, трегалозу; слабо усваивает (слабый рост) мальтозу, сорбозу, декстрин, этанол; не усваивает (нет роста) арабинозу, ксилозу, маннозу, галактозу, лактозу, целлюлозу, инозит, рамнозу.

Отношение к источникам азота: растет на безазотистых средах, сохраняя высокую продуктивность не менее 4,5-9•10⁹ кл•мл^-1 и высокую нитрогеназную активность от 210 до 430 нм•мл^-1, или до 3000•10^-3 мкг N₂. Хороший рост на средах с (NH₄)₂SO₄ - до 0,5%, с мелассой, но нитрогеназа (активность) снижается в этих случаях до 1000-600•10^-3 мкг N₂, т.е. в 3-5 раз.

Отношение к антибиотикам: резистентен к левомицетину, пенициллину, гризеофульвину, грамицидину. Чувствителен к ампициллину, олеандомицину, стрептомицину.

Отношение к фитопатогенным грибам: подавляет рост Verticillum dahliae, Helminthosporium sativum, Scolecothrihum sp., Botrytis cinerea, Fusarium sp. , Pythium de Barjanum, Fusarium lini, Fusarium oxysporum, Cladosporium.

Отношение к фитопатогенным бактериям: подавляет рост Streptomyces globisporus, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, Bac. sphaericus, Ps. putida, Ps. lacrimans.

Хранение штамма: на твердой питательной среде, содержащей мелассу и имеющей состав, %: CaCO₃ - 0,5; CaHPO₄ - 0,02; K₂SO₄ - 0,02; NaCl - 0,05; K₂HPO₄ - 0,03; меласса - 3; агар-агар - до 2. Инкубирование в течение 72-84 часов при (28±2)^oC, температура хранения плюс 4-10^oC.

Характерными особенностями штамма 2E-16 являются: высокая продуктивность на производственных (регламентных) средах в условиях глубинной ферментации, высокая сохранность при использовании в производстве биопрепарата на его основе (гелевая, сыпучая форма), антагонистическая активность в отношении многих фитопатогенных микроорганизмов, высокая приживаемость в прикорневой зоне растений, достаточно высокая нитрогеназная активность, способность к синтезу ИУК.

Пример 1. Для сравнения продуктивности нового штамма 2E-16 с известным штаммом 92 проводили выращивание в колбах на качалке при 180-200 об•мин^-1 в течение 60 часов при температуре плюс (28±2)^oC на жидкой питательной среде следующего состава, %: меласса - 3,0; K₂HPO₄ - 0,03; CaHPO₄ - 0,02; NaCl - 0,05; CaCO₃ - 0,5; K₂SO₄ - 0,02.

Результаты приведены в таблице 1.

Пример 2. Для сравнения антагонистической активности шт. 2E-16 и известного, шт. 92, проводили их выращивание в колбах на качалке на жидкой регламентной среде: время ферментации 60 часов, температура ферментации (28±2)^oC, режим аэрации-перемешивания 180-200 об•мин^-1; состав среды, %: сахароза - 2,0; K₂HPO₄ - 0,03; CaHPO₄ - 0,02; NaCl - 0,05; CaCO₃ - 0,5; K₂SO₄ - 0,02; смесь микроэлементов для выращивания - 1 мл/л. Активность определяли методом "колодцев" через 2-5 суток роста тест-культур на диагностических средах и выражали в мм зоны отсутствия роста их (размер зоны подавления роста определяли в мм).

Результаты приведены в таблице 2.

На основе данной бактериальной культуры Azotobacter chroococcum (штамму присвоен номер 2E-16, коллекционный номер в музее культур ЗАО "Биофлора" В-05) разработан препарат, который предназначен для использования в сельском хозяйстве - для повышения урожайности с/х культур, а также для оздоровления почв, инфицированных фитопатогенной микрофлорой, развившейся вследствие длительной эксплуатации почв в режиме так называемого "интенсивного земледелия", при восстановлении (рекультивации, ремедиации) нарушенных земель. Товарная форма препарата - гелевая (жидкая), сыпучая (сухая, торфяная).

Пример 3. 80 мл жидкой культуры Az. chroococcum шт. 2E-16, выращенной, как описано в примере 2, вносили в 420 г стерильного торфа. Одновременно вносили смесь микроэлементов Zn, Mg, Mn, Co, Fe, Mo, в форме комплексонатов на основе ОЭДФ суммарно в количестве 3 мг, а также регулятор роста на основе арахидоновой кислоты в количестве 10^-5% и питательные добавки - мелассу 0,2 г., мел 0,1 г., стабилизатор (пропионат кальция, бензоат натрия, аскорбат) в количестве 150 мг суммарно, гумат калия в количестве 14 мл. Полученную смесь перемешивали на втряхивателе и оставляли на доращивание при температуре 20±2^oC в течение 7 суток. После доращивания сыпучий препарат содержал 12,2•10⁹ клеток/г. Препарат использовали для оздоровления тепличного почвогрунта при подготовке теплиц из расчета 80 • 10⁶ клеток азотобактера на 1 м² площади теплицы. Через 3 суток после внесения препарата в почвогрунт отбирали пробу и определяли содержание фитопатогенных грибов. Результат сравнивали с содержанием фитопатогенных грибов в почвогрунте после "пропарки" (тепловой обработки). Результаты опытов приведены в таблице 3; исходное количество фитопатогенных грибов до внесения препарата принято за 100%.

Пример 4. В жидкую культуру Az. chroococcum шт. 2E-16, содержащую 25•10⁹ кл•мл^-1, вносили стабилизатор (пропионат кальция, бензоат натрия, аскорбат) в количестве 450 мг суммарно на 2 л жидкой культуры, а также микроэлементы в количестве 12 г (суммарно) в виде комплексонатов Zn, Mg, Mn, Fe, Co, Mo, гумат калия в количестве 40 мл; полученный жидкий препарат осторожно перемешивали и применяли для обработки (внесения в почву) посадок сеянцев ели (внекорневая подкормка), картофеля (полив всходов), капусты поздней (подкормка рассады накануне высадки в грунт), томаты (внекорневая подкормка), огурцы (полив всходов). Вели морфофизиологические и фенологические наблюдения, учитывали урожай продукции, определяли некоторые параметры, характеризующие качество продукции. Результаты приведены в таблице 4. Контроль (100%) - показатели продукции с участков, не обрабатываемых заявляемым препаратом.

Пример 5. Жидкую культуру Az. chroococcum, шт.2E-16, содержащую 25•10⁹ кл•мл^-1, смешивали со стабилизаторами и микроэлементами, вносили гумат, как описано в примере 4. Полученный жидкий препарат высушили на установке Аэроматик (сушка в псевдокипящем слое), напыляя жидкий препарат на биогумус, полученный путем биоконверсии с помощью вермикультуры. Содержание бактериальных клеток в полученном препарате составляло при высушивании 1000 мл жидкого препарата и 2 кг биогумуса 8,5•10⁹ клеток•мл^-1, влажность препарата после сушки 9,2%. Полученный препарат использовали для проверки эффективности в опытах по рекультивации площадей, нарушенных выбросами шлама горно-обогатительного комбината (г.Качканар, Северный Урал).

Пример 6. Образцы препарата, полученного в примере 5, вносили в шлам, отобранный с площадей, нарушенных сбросами шлама горно-обогатительного комбината. Через 2 месяца после внесения препарата (препарат вносили из расчете 5 кг/га) определяли приживаемость азотобактера в прикорневой зоне травы, посеянной одновременно с внесением препарата. Наблюдения на обработанном участке вели в течение трех лет. Результаты приведены в таблице 5.

Таким образом, получен новый штамм Azotobacter chroococcum 2E-16, который обнаруживает несколько полезных свойств и может стать основой препаратов (различные товарные формы), состав которых разработан и новый препарат может быть использован как для повышения урожайности с/х культур, так и в зеленом строительстве (для озеленения населенных пунктов), при восстановлении нарушенных земель, обнаружив при этом не только высокую приживаемость даже в безжизненных грунтах (например, в шламах после обогащения руд), но и высокую эффективность при подавлении фитопатогенной микрофлоры почвы. Состав компонентов, вносимых в препарат, таков, что в процессе действия препарата они полностью потребляются либо самим микроорганизмом, либо участвуют в процессах, на которые расчитан препарат в применении.

Источники информации
1. Патент РФ N 2074158. Опубл. Бюллетень N 6, 1997.

2. Авт. свидетельство СССР и 922105. Опубликован 23.07.82. Бюл. N 15.

3. Патент РФ N 2074159. Опубл. Бюллетень N 6, 1997.

4. Тезисы докладов совещания 28-29 июля 1995, г.Анапа.

Изобретение относится к биотехнологии и сельскохозяйственной микробиологии, в частности к получению биопрепарата для повышения почвенного плодородия и восстановления нарушенных земель. Получен новый штамм бактерий Azotobacter chroococcum 2Е-16 методом аналитической селекции природных изолятов по принципу отбора высокопродуктивных продуцентов, обладающих достаточно высокой нитрогеназной активностью, антибиотической активностью в отношении микроорганизмов-фитопатогенов, а также высокой приживаемостью в почве и грунтах. Штамм хранится в коллекции микроорганизмов ЗАО "Биофлора" под N В-05. Штамм используется в качестве продуцента для получения биопрепарата, применяемого в сельском хозяйстве при восстановлении нарушенных земель, для повышения почвенного плодородия. Препарат содержит бактериальную культуру Azotobacter chroococcum 2Е-16, выращенную на безазотистой питательной среде, субстрат-носитель в виде торфа или биогумуса, стабилизатор - бензоат натрия, пропионат кальция, аскорбат в суммарном количестве 0,001-0,03% и микроэлементы в виде комплексонатов Zn, Mg, Mn, Fe, Co, Mo в количестве 0,0001-0,002 %, гумат калия в количестве 0,1-3 % и регулятор роста в виде дериватов арахидоновой кислоты в количестве 10^-3-10^-5%. Внесение в почву расчетного количества бактериальной культуры Azotobacter chroococcum 2Е-16 или препарата на его основе оздоравливает почву, повышает ее плодородие, позволяет сократить расход азотных минеральных удобрений, повысить урожай культур и качество его. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Штамм бактерий Azotobacter chroococcum ЗАО "Биофлора" N В-05 для получения биопрепарата для повышения почвенного плодородия, повышения урожая сельскохозяйственных культур и качества его, оздоровления почвы и восстановления нарушенных земель. 2. Биопрепарат для повышения почвенного плодородия, повышения урожая сельскохозяйственных культур и качества его, оздоровления почвы, восстановления нарушенных земель на основе Azotobacter chroococcum, выращенного на безазотистой питательной среде, отличающийся тем, что он дополнительно содержит микроэлементы, гумат калия и стабилизатор, а из бактерий Azotobacter chroococcum он содержит штамм по п.1. 3. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что он дополнительно содержит регулятор роста в виде дериватов арахидоновой кислоты в количестве 10^-3-10^-5%. 4. Биопрепарат по п. 2, отличающийся тем, что дополнительно содержит 70-85% торфа, 0,02-0,05% мела и питательные добавки для сохранения свойств штамма по п.1 в количестве 0,04-0,1% от массы препарата. 5. Биопрепарат по п. 2, отличающийся тем, что дополнительно содержит биогумус. 6. Биопрепарат по п.2, отличающийся тем, что он содержит стабилизатор в виде пропионата кальция, бензоата натрия и аскорбата в количестве 0,001-0,03% суммарно, микроэлементы Zn, Mg, Mn, Co, Fe, Mo в виде солей или комплексонатов в количестве 0,0001-0,002% суммарно и 0,1-3% гумата калия.