Штамм бактерий АZотовастеR снRоососсUм-несимбиотический азотфиксатор для ячменя Советский патент 1988 года по МПК C05F11/08 C12N1/20 C12R1/65 C12N1/20 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и представляет собой новый штамм азотобактера, который может быть использован для разработки и производства бакте™ риального удобрения, повышающего уро жай и содержание азотг в ячмене на бедной по азоту почве без внесения минеральных азотных удобрений, ив научно -исследовательской работе.

Целью изобретения является получе ние нового штамма азотобактера, фиксирующего атмосферный азот, выделяющего ростовые вещества и обладающего сродством к поверхности корней, т.е. вступающего в ассоциативный симбиоз с ячменем, а также имеющего ге}1ети- ческую метку, позволяюио ю легко отличить его от природных штаммов.

Штамм получен путем многоступенчатой селекдии бактерий па поверхности корней ячменя, предварительно обрабо танных в почве шт;1ммом Ar.otc ijacter c :.rnocc ;;c-.j:. К (Ь:; , несущим транс- миссивную плазмиду, позволяющую генетический обмен с широким кругом природных видов бактерий ризоплапы. Azob 1 4Ct,or hr: :.r пес .:-: К(р; ) полученный из штамма Ai ot С рас ler cl .i ooJccc -j . il, хранится в Центральном Музее промышленных микроорганизмов под № ЦМПМ В-2375. В Центральном музее промьш1ленных микро(рганизмов HOBbul штамм зарегистрирован под N В-3173.

Штамм A;;.jl: ;.г1с1: ег chr- vococcuri 3-3173 имеет следующие морфологические и физиологические характеристик Морфолог ические признаки. При росте штамма В-3173 на агари- зованной среде Ьэрка - штрих двухсуточной культуры цвета слоновой кости, слизистой консистенпии с волнистыми краями, непрозрачный, поверх- ность блестящая, колонии округлой формы в диаметре 1,5-2,5 мм с ровными краями, непрозрачные, двета слоновой кости, более слизистой консистенции, чем штрих.

Клетки штамма ii-3173 в молодом возрасте имеь:1Т форму толстой палочки С закругленными концами (3-7 х 1,5- 2,Ь , покрытой студенистой капсулой. Имеются жг -тики. В зависимости от возраста и среды могут иметь самые разнообраз {ые формы и размеры: кокки, сардины. Клетки могут быть расположены одиночно, парами, короткой

г

5 0

5 0 5

0 5 Q

5

цепочкой и сарциноподобными пакет г- ками, окруженными общей капсулой. Покоящаяся форма - циста. При старении культура приобретает коричневую ок раску. Пигмент не проникает в среду. Окрасить клетки можно анилиновыми красителями по Граму.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм В-3173 - аэроб. Оптимальная температура роста 28-32 0, минимум - 10°С, максимум - 45°С. Реакция штамма на рН: оптимум 7-7,8, максимум - 9, минимум - 6.

Штамм В-3173 ассимилирует следующие источники углерода; глюкозу, левулезу, декстрин, галактозу, сахарозу,мальтозу, арабинозу, ксилозу и маннозу - из спиртов: маннит, глице рин и этиловый спирт.

В-3173 не ассимилирует соли формиатной, салициловой, олеиновой кислот, метиловый спирт, фенол, целлюлозу, гелицеллюлозу, лигнин.

Штамм В-3173 использует свободный азот, азот аммониевых, нитритных и нитратных солей. Нитратный и нитрит- ный азот сначала превращается в аммоний, а затем уже используется азотобактером.

Штамм В-3173 для развития нуждается в магнии, кальции, в небольщих количествах молибдена и железа.

Штамм В-3173 на МПА растет плохо. Колонии двухсуточной культуры имеют в диаметре 0,5-1 мм и более интенсивную окраску.

Штамм В-3173 в отличие от штамма К обладает повышенной способностью прикрепляться к поверхности корней ячменя и функционировать на них не менее 2 мес. после инокуляции.

Пример I. Недельные проростки растений ячменя сорта Фаворит, растущие на жидкой питательной среде, обрабатывают равным количеством клеток штаммов В-3173 (опыт) и К (контроль) и продолжают выращивание на свету в течение суток. Затем корни отделяют и последовательно отмывают в семи колбах со средой Бэрка (две последние с песком), как при селекции штамма. Равные навески корней растирают в измельчителе и после разведений высевают на индикаторную среду Бэрка. В результате подсчета колоний в ризоплане ячменя обнаружено 26±5 -1 О клеток штамма В-3173 на 1 г корней и 2 + 1,4-10 клеток щтам

ма К на 1 г корней. Таким образом, способность клеток штамма при крепляться к поверхности корней яч меня сорта Фаворит в 13 раз выше, чем у известного штамма.

Наличие клеток штамма В -3173 на поверхности корня в процессе вегета - ции ячменя после инокуляции почвы с недельными проростками растений оп ределяют методом обрастания. Через 1,2 мес вегетации корни, очищенные от почвы, накладывают на поверхность индикаторной среды. Через двое суток отмечают интенсивное и одновремен ное обрастание поверхности корней сплошной массой клеток штамма В-3173 В контроле при обработке штаммом К сплошного обрастания не обнаруживают. Таким образом, клетки штамма 5-3173 обладают способностью колонизировать поверхность корней ячменя сорта Фаворит по крайней мере в течение 2 мес. после инокуляции.

Штамм 3-3173 вьщеляет во внешнюю среду белок, отсутствуюший у штамма К, и обладает повьшенным по сравнению со штаммом К синтезом другого белка. Эти белки, обнаруженные при сравнении электрофореограмм экзобел- ков штаммов В-3173 и К (чертеж,, возможно ответственны за сродство клеток штамма В-3173 к ризоплане ячменя.

Штамм В-3173 обладает способностью в определенных условиях формировать азотфиксирующую ассоциацию с ячменем. Азотфиксация растений ячменя, обработанного культурой штамма В-3173 в вегетационных сосудах с дерново- подзолистой почвой без азотных удоб- рений, измеренная ацетиленовым методом, Bbmie, чем азотфиксация в природной ассоциации без инокуляции.

Пример 2. Вегетационные сосуды с дерново-подзолистой супесча- ной почвой (10 кг на сосуд без минеральных азотных удобрений, 1) без растений, 2) с культурой ячменя сорта Фаворит в стадии колошения, 1. 1 и 2.1) инокулированные бактериями штамма В-3173 через 10 дней после прорастания - по 50 мл суспензии клеток с концентрацией 10 кл/мл на сосуд, 1.2 и 2.2) без инокуляции) гер-

метично закрывают изолятором из полиэтиленовой пленки объемом 10 л. В изоляторы вводят по 0,4 л ацетилена. Через 24 ч берут пробы газа и анализируют на газовом хроматографе Хром-5. Содержание этилена в пробах приведены в табл. 1.

Таблица 1

10

15

0

Почва без

растений Штаммом В-3173

Ячмень Штаммом сорта В-3173 Фаворит

Следы

0,21 0,046

25

Из данных табл. 1 следует, что клетки штамма В-3173 формируют азот- фиксирующую ассоциацию с ячменем, превышающую по нитрогеназной активности ассоциацию ячменя с дикими поч- венными диазотрофами.

Штамм В-3173 при инокуляции бактерий в корневую зону проростков обладает способностью повышать продуктивность растений ячменя по содержанию общего азота и особенно небелкового азота свободных аминокислот.

Пример 3. В вегетационном опыте (по 6 сосудов с 60 растениями в каждом варианте опыта) дерново- подзолистую почву с недельными проростками ячменя сорта Фаворит иноку- лируют (25 мл на сосуд) суспензией клеток штамма В-3173 в концентрации

о

10 кл/мл. После вегетации исследуют содержание общего и небелкового азота в зерне. В варианте опыта без добавления в почву азотных удобрений количество азота в зерне в процентах от абсолютно сухой массы составляет (табл. 2).

Опыт с инокуля - цией

Контроль без

1,94

прибавка достоверна

Штамм обладает способность к стимуляции роста ячменя при обра- ботке семян.

Пример 4. Семена ячменя сорта Фаворит после стерилизации верхности 70% -ным этанолом и диацидо проращивают в колбах со средой Бэрка (контроль) и с суспензией штаммов К и В -3173 в среде Бэрка {по 10 мл с концентрацией 10 кл/мл на 1 колбу) и инокулируют на светоустановке в течение 8 дней (3 опыта по 6 поверхностей). Затем проростки извлекают и взвешивают. Биомасса проростков, ино кулированных штаммов К и В-3173, пре BbmiaeT контроль соответственно на 90% и 106%. Таким образом, ростости- мулирующая способность штамма В-ЗПЗ на 16 выше, чем штамма К, даже при условии искусственного насыщения корней бактериями известного штамма.

Штамм В-3173 обладает устойчивостью к ампициллину, канамицину и тетрациклину в концентрациях 100; 10 и 50 мкг/мл соответственно.

Уровень устойчивости определяют по максимальной концентрации антибиотиков в среде Бэрка, при которой рос

К В-3173

6,65+0,2710,8j4-0,34l,2jfO,045

8,,4112,,61,3+0,016

Таблица 2

0,17

1,77

10,

0,05.

колоний штамма В-3173 не ингибирует- ся. Известный штамм чувствителен к этим антибиотикам и не растет при указанных концентрациях. Это свойство щтамма В-3173 можно использовать для быстрой идентификации штамма на корнях растений в полевых условиях.

Пример 5. Корни растений, инокулированных штаммом В-3173, накладывают на поверхность агаризован- ной среды Бэрка, содержащей ампициллин, канамицин и тетрациклин в концентрациях 100; 10 и 50 мкг/мл соответственно. Через 2 сут наблюдают сплошное обрастание корней биомассой клеток штамма В-3173 при отсутствии сплошного обрастания у штамма К.

Пример 6. Предлагаемый штамм повышает урожайность ячменя и усвоение им азота. Это видно из результатов, представленных в табл. 3. В табл. 3 показано сравнение влияния инокуляции проростков ячменя сорта Фаворит штаммами К и В-3173 на урожай зерна и содержание азота в зерне в вегетационных опытах на дерново- подзолистой почве (1985 г).

Таблица 3

Достоверность разностей, Р 0,05

Штамм В -ЗПЗ может быть использо - ван для приготовления бактериального удобрения на торфяной основе, которое мы назвали Ризофил за способность бактерий прикрепляться к корням рас тений.

Пример 7. Штамм выращивают в ферментере на модифициро ванной среде Бэрка следующего соста - ва (см. табл. 4).

Таблица 4

Сахар пищевой 10,00 195,0

,64 12,5

КН,,163,1

MgS040.203,9

NaCl0,203,9

Case 4-2Н,0 0,051,0

,001 0,002

AzotoЪacter chroococcum Azotobacter chroococcum Б -3173

Продолжение табл. 3

0,05

0,05

Продолжение табл.4

20

,003 0,006

Дрожжевой

экстракт 0,5 9,8

Пеногаситель

(олеиновая

кислота) 0,1 1,95

Водопроводная

вода1л 19,5 л

рН 6,,0 доводится 20% -ным раст вором NaOH или разбавленной ЧС1 до концентрации 10 кл/мл, и культураль чую жидкость инокулируют в полизтиле-- новые пакеты с простерилизованными гамма-лучами в дозе 2-10 г измель - ченным торфом. Соотношение массы ино кулята и торфа 1:3. После поращивания в термостате при 28°С в течение 3 сут удобрение готово к использованию.

В табл. 5 представлены сравнительные данные по сродству к ризоплане ячменя и наличию генетической метки известного и селекционированного штаммов.

Таблица 5

2+1,4

Отсутствует Отсутствует

26+5

Полное

Полная

Штамм Azctobacter chroococcuin , обладающий повышенным срод- ством к ризоплане ячменя и генетичес кой меткой, может быть использован в сельском хозяйстве для создания но вых бактериальных удобрений и разра ботки рациональных способов их применения. Формула изобретения

Штамм бактерий Azotobacter chroo- соссшп № ЦМПМ 3173 - несимбиоти- ческий азотфиксатор для ячменя.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии. Оно представляет собой новый штамм азотобактера. Штамм обладает сродством к ризоплане ячменя и имеет генетическую метку. Размножается и функционирует на ризоплане ячменя по крайней мере в течение 2 мес. Штамм вызывает ростостимулирующий эффект, продуцирует гетероауксин, витамины группы В, гиббереллин, формирует с ячменем азотфиксирующую ассоциацию, повьппает урожай и продуктивность растений по содержанию азота. Штамм может быть использован для создания бактериального удобрения под ячмень. 5 табл. (О (Л СО 05 00 со

Штампы Azototoacter

chroococcum К

A2Qtobacter

chroococcum

В-3173

I I

nm

Лобышенное

со ержание

Но&ыи д ело/(