Способ определения канцерогенез-промоторной активности химических веществ Советский патент 1990 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

Изобретение относится к медицине п частности к онкологии, и может бы нспользонано для оценки безопасност химических веществ для выявления пр моторной активности различных лекарств, субстанций лекарственных форм, веществ, используемых в пищевой промьгашенности, бытовой химии, на химических производствах, в сельском и лесном хозяйстве, и определения доз веществ, при которы х зта активность будет проявляться.

Цель изобретения - ускорение способа за счет сокращения срока введе ния исследуемого вещества и последующего измерения изменения силы сцепления клеток в органах животного.

Способ осуществляют следующим образом.

ЖИВ.ОТИЫМ (линии устойчивые к спотанному бластомогенезу) в молодом возрасте вводят исследуемое веществ в интересующем дозовом интервале, кторый лежит в пределах нетоксически доз. Через 2А-48 ч животных забиваю органы извлекают и, отрывая стеклянной микроиглой с помощью микроманипулятора клетки, расположенные на краю кусочка ткагш, по величине прогиба иглы определяют силу сцепления клетки с Тканью. Заключение о наличии промоторной активности у исследуемого вещества делают на основани снижения силы сцепления клетрк в хотя бы одной ткани ниже критического значения. При этом .пороговой считается та доза вещества, при введении которой сила сцепления клеток достигает критического значения. Критичес кие значения сил сцепления клеток в разных тканях определяют цредвари- тельно.

Измерение силы сцепления клеток осуществляют по методу Комана следующим образом.

Кусочек ткани закрепляют на предметном стекле желатиной. Затем под контролем микроскопа в клетку, нахо

дящуюся на краю кусочка, втьжают мик роиглу (диаметр кончика менее микро

на, игла откалибрована на величину прогиба с помощью проволочных микрогрузиков) . Иглу перемещают с помощью пневматического микроманипулятора Фонбрюна, положение кончика иглы регистрируется окуляр-микрометром. После протыкания клетки иглой последняя постепенно отводится в сторону, так

0

5

0

5

0

0

5

5

что создается отрывающее клетку от ткани усилие, при этом игла изгибается, а при oTpbtBe клетки распрямляется. Фиксируется положение кончика иглы непосредственно до отрыва клетки и после отрыва. Для каждого кусочка ткани проводят 10-30 измерений сил отрыва отдельньгх клеток. Повторяют измерение-на 3-5 животных для каждого варианта опыта. Величину силы сцепления выражают в мг/клетку, для чего используют калибровочный график: величина прогиба - сила, который строят для каждой калибровочной иглы.

Испытуемое вещество обычно вводят животному в дозах, образующих логарифмический ряд, таким образом, как желательно испытать (в/б, per 6s, в питье и т.д.). Животное забивают растяжением позвонков и быстро извлекают кусочки органов (печень, легкие, пщтовйдную железу, аналогично можно определять силу сцепления почек, поджелудочной железы, желудка, слюнных желез, матки, молочной железы), освобождают их от.капсулы и помещают на время измерений в раствор Эрла . прн комнатной температуре. .

Способ поясняется следующими примерами.

П р и м е р 1. Определяют пороговые дозы промотора канцерогенеза печени - фенобарбитала. Мыши линии Су,Ы в возрасте 2 месяцев получают разные дозы фенобарбитала в течение 2 суток. Затем мышей забивают и определяют силу сцепления клеток в печени. На каждую точку берут по 3 мы-- ши. В каждой печени измеряют, по 20 клеток. Результаты этого опыта представлены в табл. 1.

Сила сцепления клеток в печени при различном содержанки фенобарби- тала в диете.

Кр итическая сила сцепления клеток определена для печени ,на уровне 0,10±

мг/кл.

Эксперименты, кроме мьппей линии , ставились на линиях A/Sn,CBA, а также беспородных крысах. Выбор ли- НИИ определялся тем, чтобы выявить влияние промотора (фенобарбитала) на силу сцепления клеток в зависимости от исходной силы сцепления, характерной для данной линии. Данные приведены в табл. 2.

Из данных Тс1бл, 2 лидмо, что дозы фенобарбитала, вызыпаюпще промоторны эффект, снижают сцепление ниже порогового значения, определенного независимо для спонтанного канцерогенеза Величина эффекта больше у сильно сцепленных линий или беспородных крыс и тем меньше, чем меньше исходное значение силы сцепления.

П р и м е р 2. Определяют канцеро генез-промоторную активность бутил- гидрокситолуола (ионола) как описано в примере 1. В табл. 3 и 4 представлены результаты изучения влияния ионола на силу сцепления клеток легких и г1ечени.

Видно хорошее соответствие порогов промоторного эффекта и снижения силы сцепления ниже порога, определенного независимо на моделях спонтанного канцерогенеза.

П р и м е р 3. В табл. 5 приведены данные о соответствии между эффектом веществ на силу сцепления в ткани и наличием у этого вещества промоторного эффекта на данный орган.

Данные о промоторном эффекте выражаются в полулогарифмическом масштабе, поэтому пороговая доэа приводится с точностью до полупорядка.

Положительный эффект предлагаемого способа в сравнении с прототипом заключается в том, что эффект промотора оценивается через 1-2 суток после начала эксперимента, а не через. 7-8 месяцев, что дает выигрьпп во времени в 100-150 раз.

Формула и.зобр

тения

Способ определения канцерогенез- промоторной активности химических

Линейные и видовые отличия влияния различных концентра1Щй фенобарбитала на силу сцепления клеток печени в % от исходной величины

веществ путем введения разных доз исследуемого вещества экспериментальным животным с последующим извлечением органов и их исследованием, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, животных,.забивают через 1-2 суток после введения исследуемого вещества, определяют силу сцепления клеток в органах и при значении этого показателя ниже значения критической силы сцепления клеток хотя в одной ткани определяют канцерогенез-npoMoTopHjTo активность вещества.

Таблица t

0

0

5

0

Содержаниефенобарбиталав диете, Z 5 ,-

О

Сила сцепления клеток в печени

Заключение

0,002

0,01

0,025

0,05

0,lA5tO,015 0,121+0,010

0,098±0,003 0,073±0,003

0,,003

Не облала- ет промо- торной активностью

Пороговая доза

Наличие промотор- Ной актив- ности

Таблица 2

0,004

Сила сцеплеиия у интактных животных

-17+9

-15+9

-4+1,4

-15+2

0,Й8+0,005 0,12140,004 0,071±0,003 0,11/«±0,003

Значение .пороговой силы сцепления - 0,090-0,100.

TinnMui 3 Ктшнн иокоЛ снАу сиепжмм «л«то1с лепснк (« иг/|гл т11у) A/Sn

Таблица 4

Влияние ионола на силу сцепления гепатоцитов мьппей A/Sn (в мг/клетку) в разные сроки после введения ионола и промоторный эффект

Контроль 0,123+0,002 0,121+0,002 0,122+0,0015

0,80,122+0,002 0,116+0,003 0,121+0,002 Нет эффекта

it,О0 116+0,002 0,117+0,003 0,109+0,003

100,102+0,002 0,114+0,003 0,116+0,003 Неопределенный.

эффект

20 0 077+0 002 0 075±0j 002 0 084+0 002 Промоторный эффект на некоторых линиях

100 OAO§liOi0215 2jL2§24Qi2215 2x215+0 002 ПРОМОТОРНЫЙ, эффект

Подчеркнуты значения ниже порога (0,10); среднее значение силы сцепления - 0,1215.

Продолжение табл. 2

ЕП

-15+9

-4+1,4

-15+2

Промоторная активность различных веществ и их влияние на силу сцепления клеток Тиобарбитуроваякислота

Ионол

0

« - наличие промоторного эффекта, о - отсутствие промоторного эффекта. О - эффе.кт меньше 5%.

Составитель Н.Гуляева Редактор М.Кузнецова Техред А.Кравчук Корректор М.Демчик

2491

Тираж 520Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам,изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

. Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная,4

Таблица 5

11 + 5

о

Изобретение относится к медицине, точнее к онкологии, и предназна-. чено для оценки безопасности химических веществ, используемых в пищевой промьщ1ленности, бытовой химии, в сельском, лесном хозяйстве, в химическом производстве. Цель изобрете ния - ускорение способа путем сокращения срока введения .исследуемого вещества и измерения силы сцепления клеток в органах животного. Испытуемое вещество вводят животному в дозах, образующих Логарифмический ряд. Через 24-48 ч животных забивают, органы извлекают и, отрывая стеклянной микроиглой клетки, расположенные на краю кусочка ткани, по величине прогиба иглы определяют силу сцепления клетки с тканью. При этом пороговой считается та доза вещества, при введении которой сила сцепления клеток достигает критического значения. Заключение о наличии каицерогенез-промо- торной активности у исследуемого вещества делают на основании снижения силы сцепления клеток хотя бы в одной ткани Ниже критического значения. 5 табл. с (/) СО о К) ю а 05