СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ПОВЫШЕННОГО ОНКОЛОГИЧЕСКОГО РИСКА Российский патент 1997 года по МПК A61K35/78 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано преимущественно для профилактики доклинических форм заболевания злокачественными новообразованиями (онкологического риска).

На современном этапе развития онкологии общепринятой является точка зрения, согласно которой улучшения результатов лечения злокачественных опухолей можно ожидать от предложения новых и совершенствования известных методов профилактики только на доклинических стадиях заболевания, называемых онкологическим риском.

В настоящее время накопились фактические материалы, показывающие, что процессы, приводящие к злокачественному перерождению клеток, могут до формирования опухолей вызывать иммуно-метаболические нарушения, характерные для канцерогенеза. Однако методов предотвращения рака, основанных на фармакологической профилактике путем устранения ранних специфических для канцерогенеза иммуно-метаболических нарушений, не имеется.

Представляется перспективным путем профилактики разработка новых методов торможения образования в организме специфических факторов повышенного онкологического риска маркеров канцерогенеза-аддуктов канцерогенов с биологическими макромолекулами канцероген-белковых антигенов (КБА) и коррекция связанных с их появлением нарушений гуморального и клеточного иммунитета.

Заявка посвящена разработке новых нетрадиционных средств профилактики ранних стадий канцерогенеза, основанных на фармакологическом использовании летучих фракций биоактивных веществ растительного происхождения для коррекции специфических иммуно-метаболических нарушений, возникающих в период инициации канцерогенеза на стадии онкологического риска.

В материалы заявки входят: 1) результаты экспериментального скрининга эфирных масел с целью отбора наиболее эффективных соединений, способных тормозить образование канцероген-белковых аддуктов, и 2) результаты исследований действия этих соединений на регистрацию факторов онкологического риска КБА у рабочих резиновой промышленности с повышенным профессиональным онкологическим риском.

Прототипом заявляемого изобретения является способ подавления образования КБА у рабочих путем внутримышечного введения им аскорбиновой кислоты в суммарной дозе 2,5 г в течение двух недель (Коростелева Т.А. Белохвостова А. Т. Кузнецов С.И. О возможности нормализации обмена триптофана у рабочих с профессиональным онкологическим риском аскорбиновой кислотой.//Мед.реф.журнал, 1982, N 5, Раздел 17, публ. 1594). Недостатком этого способа является незначительная эффективность действия на регистрацию КБА, содержащих бензидин, а также возможность осложнений при введении высоких доз аскорбиновой кислоты, связанных с ее действием на систему свертывания крови.

Цель изобретения повышение эффективности профилактики повышенного онкологического риска путем использования эфирных масел для торможения образования факторов онкологического риска КБА и нормализации вызываемых ими иммуно-метаболических нарушений.

Цель достигается тем, что в известном способе подавления образования КБА вместо аскорбиновой кислоты, согласно изобретению, используют ингаляционное введение эфирных масел шалфейного и гвоздичного.

Научные основания для предложения новых модуляторов канцерогенеза были получены нами в результате: 1) систематических исследований иммунологии ранних стадий экспериментального химического канцерогенеза и 2) путем скрининга среди биологически активных веществ разного строения модуляторов, перспективных для фармакологической профилактики доклинических стадий малигнизации.

Изучение в динамике иммунологических процессов позволило выявить на ранней стадии канцерогенеза наиболее важные специфические нарушения иммуно-метаболических реакций, могущие послужить объектами нормализации при помощи новых модификаторов.

Исследования иммунологии ранних стадий экспериментального канцерогенеза, которые могут рассматриваться как экспериментальная модель профессионального онкологического риска, показали, что его специфическими маркерами могут являться КБА, образующиеся в организме в результате взаимодействия канцерогенов с белками (Коростелева Т.А. Об изменениях тканевых антигенов в процессе экспериментального канцерогенеза.-Л:Медицина, 1966. -247 с.). Взаимодействие канцерогенов с макромолекулами белками и нуклеиновыми кислотами является универсальным ключевым звеном в процессах, ведущих к малигнизации клетки. Оно было установлено в результате многочисленных биохимических исследований как в России, так и за рубежом. Приоритет в области изучения иммунологических аспектов образования аддуктов канцерогенов с белками принадлежит профессору Т.А.Коростелевой. Под руководством Т.А.Коростелевой были выполнены работы, показавшие, что канцерогенные для человека соединения как экзогенного (2-нафтиламин, бензидин, диметиламиноазобензол), так и эндогенного происхождения (3-оксиантраниловая кислота) при поступлении в организм животных взаимодействуют с белками ткани-мишени, образуя КБА (Засыпка А.Т. Изучение антигенного строения тканей на ранних стадиях экспериментального канцерогенеза под влиянием бензидина. //Вопр.онкол.-1969, N 3, с.61-66; Коростелева Т.А. Засыпка А.Т. Изучение аномальных антигенов и соответствующих антител при действии 3-ОАК in vivo.// Вопр.онкол.-1969, N 9, с.53-58). В этих антигенах гаптенами являются канцерогены, а антигенными носителями альбумины и α-глобулины. Присоединение канцерогенов к белкам изменяет их первичную специфичность, придавая им новую хемоспецифичность, обусловленную группировкой присоединившегося канцерогена. КБА циркулируют в организме и могут быть обнаружены в биологических жидкостях иммунологическими методами.

На ранней стадии экспериментального канцерогенеза под влиянием канцероненов, у лиц с профессиональным онкологическим риском и у больных с опухолями различных локализаций обнаруживается КБА, содержащий в качестве гаптена эндогенный канцероген-3-оксиантраниловую кислоту (3-ОАК). 3-ОАК- эндогенный канцероген, появляющийся в крови в результате нарушения кинуренинового пути обмена триптофана (Рудзит В.К. Триптофан (в норме и патологии).-Л:Медицина, 1973, с. 141; Засыпка А. Т. Канцерогенные метаболиты триптофана (обзор)// Вопр.онкол.-1969, N 7, с.108-118).

Образование КБА в организме сопровождается различными нарушениями гуморального и клеточного иммунитета. Проведенные нами исследования влияния КБА на иммунореактивность показали, что эти антигены представляют онкологическую угрозу не только потому, что содержат канцерогены, но и характером своего воздействия на организм. КБА вызывают нарушения наиболее важных факторов противоопухолевой защиты организма T и B-систем иммунитета.

Фактические материалы, накопленные ранее при экспериментальном изучении роли КБА в динамике канцерогенеза, в настоящее время нашли практическое применение при профилактических осмотрах, направленных на выявление групп онкологического риска среди промышленных рабочих.

Результаты наших экспериментальных и клинических исследований показали, что КБА, содержащие эндогенный канцероген- 3-ОАК, и экзогенные канцерогены, могут быть использованы для достижения цели изобретения как маркеры контроля и регистрации профилактического и терапевтического действия новых предлагаемых модуляторов канцерогенеза.

Новые нетрадиционные лекарственные средства для коррекции иммуно-метаболических нарушений, возникающих при инциации канцерогенеза, разрабатывались нами на основе растительных биоактивных веществ. В настоящее время среди лечебных средств, применяемых в медицинской практике для профилактики и лечения болезней, более 40% составляют препараты растительного происхождения.

Препараты растительного происхождения более безвредны для организма, чем синтетические медикаменты, что позволяет применять их длительное время. Многие фитохимические препараты, в том числе и эфирные масла, являются сложными нативными смесями биологических веществ, которые в комплексе проявляют выраженное действие, в то время как отдельные составные части оказываются неэффективными (Николаевкий В. В. Еременко А.Е. Иванова И.К. Биологическая активность эфирных масел. Л.Медицина, 1987, с.247). Существенно так же то, что растительные биоактивные вещества способны действовать на организм в виде летучих фракций при поступлении через дыхательные пути в предельно низких природных концентрациях.

Эволюция живых организмов осуществлялась в контакте с растительными биологически активными веществами, что привело к значительной сопряженности с ними многих сторон метаболизма и к зависимости от них ряда систем организма. Известно, что природные концентрации биологически активных веществ растительного происхождения, попадая из легких в кровь, активно включаются в обмен веществ в качестве естественных звеньев важнейших биологических и физиологических процессов, в синтез биологически активных комплексов - гормонов, ферментов, витаминов, биостимуляторов.

В качестве модификаторов канцерогенеза в последние годы все шире исследуются различные биологически активные вещества природного происхождения витамины, полисахариды, ферменты, экстракты растительного происхождения и т. д. Этот интерес обусловлен тем, что многие из них действуют на различные факторы естественной противоопухолевой защиты организма, в том числе на иммунную систему, играющую важную роль в индукции, развитии и прогрессии опухоли.

Использования в качестве модификаторов канцерогенеза эфирных масел до настоящего времени не производилось.

Предпосылками для начала изучения эфирных масел как возможных модификаторов канцерогенеза служат результаты экспериментальных исследований, выполненных под руководством профессора В.В.Николаевского, которые впервые показали, что эфирные масла могут быть иммуностимуляторами, воздействуя на различные звенья T- и B-систем (Николаевский В.В. Еременко А.Е. Иванов И.К. Биологическая активность эфирных масел. М:Медицина, 1987, с.247).

Сущность изобретения заключается в следующем.

Обнаружено два масла (шалфейное и гвоздичное), способных оказывать профилактическое действие путем торможения образования аддуктов канцерогенов с белками и нормализовывать нарушения T- и B-систем иммунитета на ранних стадиях экспериментального канцерогенеза под влиянием бензидина и у рабочих с повышенным профессиональным онкологическим риском.

Предлагаемое изобретение основано на фактических материалах, полученных нами в результате сравнительного экспериментального изучения действия различных ароматических масел на иммунобиологические нарушения, регистрируемые у животных в период инициации химического канцерогенеза под влиянием бензидина, а также в результате изучения действия масел на регистрацию КБА и иммунореактивность у рабочих с повышенным профессиональным онкологическим риском.

Известно, что бензидин вызывает у мышей линии СЗНА образоваание гепатом (Прокофьев О.Г. Индукция бензидином опухолей печени у мышей.//Вопр.онкол.-1971, N 5, с.61-64). Нами было показано появление 3-ОАК- и бензидин-антигенов в сыворотке крови и в ткани-мишени печени у мышей, получавших бензидин 15 дней. Образование КБА в легких, почках и селезенке не наблюдалось.

Для достижения цели изобретения подавления образования КБА и коррекции иммунореактивности при помощи эфирных масел, экспериментальные исследования проводят по следующим этапам:
1. Получение тест-систем для определения КБА
2. Введение мышам бензидина и эфирных масел
3. Получение сыворотки крови и тканевых антигенов подопытных и контрольных животных
4. Определение влияния эфирных масел на образование КБА и иммунореактивность путем сравнительного исследования этих показателей у мышей, получавших только канцероген, и у мышей, получавших одновременно с канцерогеном эфирные масла.

1. Получение тест-систем для определения КБА
В качестве тест-систем для определения КБА используют иммунсыворотки кроликов, полученные после иммунизации их бензидин- и 3-ОАК-азопротеинами.

3-ОАК синтезируют по методу, разработанному швейцарской фирмой F.Haffman La Roche [Helvetia Chemica Acta] 34,611.1951. Точка плавления 3-ОАК 260-262^oC.

Получение 3-ОАК-азопротеинов проводят путем диазотирования 3-ОАК и последующего азосочетания диазосоединения 3-ОАК с белком.

Для диазотирования 0,0012 кг 3-ОАК растворяют в 0,1 л разбавленной соляной кислоты (в соотношении кислот:дистиллированная вода 1:4 в 0,02 концентрированной HCl и в 0,08 л H₂O). Раствор 3-ОАК охлаждают до -3^oC±1^oC и к нему в течение 2-3 минут капельно добавляют раствор нитрита натрия (0,6•10^-3 кг NaNO₂ в 0,015 л H₂O), охлажденный до 0^oC.

Азосочетание проводят в щелочной по фенолфталеину среде. Щелочную среду создают добавлением 40% раствора NaOH, для азосочетания используют 0,1 л альбуминовой фракции лошадиной сыворотки (концентрации белка в сыворотке 7-8 г% ). Использование альбуминовой фракции вместо цельной лошадиной сыворотки вызвано необходимостью устранения образования антител против общевидовых антигенов, существующих в сыворотке крови человека и лошадиной сыворотке. Образование антител против этих антигенов, относящихся по электрофоретической подвижности к глобулинам, в значительной степени затрудняет интерпретацию данных, полученных при применении в качестве тест-систем для определения КБА у рабочих иммунсывороток кроликов, иммунизированных канцероген-содержащими гетерогенными азопротеинами.

Диазосоединение 3-ОАК сразу после получения быстро приливают к раствору белка, охлажденному до 0^oC±1^oC и подщелоченному предварительно 40% раствором NaOH до положительной реакции на фенолфталеин при энергичном помешивании реакционной среды. Время азосочетания 5-7 минут.

После азосочетания реакционную смесь оставляют на 1 час в рефрижераторе при температуре +4^oС, после чего к ней добавляют 10% соляную кислоту в количестве 0,02 0,025 л для осаждения белков. После центрифугирования в течение 10 мин при 800 g/мин надосадочную жидкость сливают, осадок промывают однократно подкисленной дистиллированной водой (pH 4-5) и растворяют в минимальном объеме 0,1 N раствора NaOH. Раствор азопротеина имеет темновишневый цвет.

Полученный 3-ОАК-азопротеин диализуют против физиологического раствора при температуре +4^oC до pH исходного физиологического раствора.

Для иммунизации кроликов используют азопротеин с концентрацией по белку 4-5 г%
Получение бензидин-азопротеинов проводят путем диазотирования бензидин-сульфата и последующего азосочетания диазосоединения бензидина с белком.

Для диазотирования готовят взвесь 0,736•10^-3 кг бензидин-сульфата в растворе, состоящем из 0,6•10^-3 кг NaCl, 0,002 л H₂SO₄, взятых из 0,1 N фиксанала, и 0,004 л H₂O. К этой взвеси по каплям в течение 15-20 минут добавляют эквимолярное количество раствора NaNO₂, состоящего из 0,552•10^-3 кг соли, растворенной в 0,015 л H₂O. Диазотирование проводят в кислой среде (pH 1-2) при температуре 10-12^oC в течение 2 ч. Контроль поглощения нитрита натрия осуществляют при помощи йод-крахмальной реакции.

Для азосочетания используют белки альбуминов лошадиной сыворотки. Азосочетание проводят в щелочной по фенолфталеину среде (pH 8-10) при температуре +4^oC. Диазосоединение бензидина в количестве 0,003 л нейтрализуют 20% раствором соды до исчезновения реакции на конго-красный. К 0,1 л раствора альбуминов лошадиной сыворотки, подщелоченному 40% раствором NaOH до появления реакции на фенолфталеин, по каплям добавляют раствор диазосоединения бензидина и 40% раствор NaOH до образования малиновой окраски на фенолфталеин при постоянном помешивании реакционной среды.

Полученный азопротеин осаждают HCl 1:3. После центрифугирования при 800 g/мин в течение 10 мин надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в минимальном объеме раствора 0,1 NNaOH. Щелочной раствор азопротеина подвергают диализу против физиологического раствора до исчезновения реакции на фенолфталеин, после чего его концентрируют до 4-5 г% по белку и консервируют фенолом (из расчета 0,25 г фенола на 0,1 л раствора азопротеина).

Получение иммуносывороток против КБА.

Для иммунсывороток беспородных кроликов-самцов разводки Рапполовского питомника весом 1,5-2,0 кг. Кроликов иммунизируют водным раствором азопротеина по следующей схеме:
1) один раз в неделю внутрикожно в 10 точек спины вдоль спинного хребта на расстоянии 1,5-2 см от него в обе стороны (по 5 точек с каждой стороны) вводят 0,5•10^-3 л раствора азопротеина, содержащего 0,01 кг белка на 1 кг веса кролика, вместе с 0,5•10^-3 л адьюванта фрейнда;
2) через неделю повторяют внутрикожное введение азопротеина в той же дозе также в 10 точек спины;
3) через 2 недели вводят раствор азопротеина под обе лопатки подкожно и внутрибрюшинно в общей дозе 0,03 кг белка азопротеина на 1 кг веса кролика;
4) через 1,5 мес. вводят раствор азопротеина по 0,5•10^-3 л с содержанием белка азопротеина 0,01 кг/кг веса кролика внутривенно через день три раза в неделю. Кровь берут на 9-й день после последней инъекции. В дальнейшем кроликов реиммунизируют через 3-4 месяца, используя только внутривенное введение антигена.

После отстаивания в рефрижераторе в течение 24 часов сыворотку крови отделяют от сгустка путем центрифугирования в течение 10 мин при 1000 об/мин и консервируют борной кислотой, добавляя ее до получения насыщенного раствора. Иммунсыворотки хранят при температуре +4^oC. Перед употреблением иммунсыворотки концентрируют в 2 раза в целлофановых трубках под вентиляторами.

Определение титра иммунсывороток проводят при помощи реакции связывания комплемента. Определение титра противогаптеновых антител (антител против канцерогенов как гаптенов) проводят при помощи реакции связывания комплемента, используя в качестве тест-антигена азопротеин, содержащий тот же канцероген, но другой белковый носитель, полученный тем же способом, что и азопротеин, использованный для получения тестируемой иммунсыворотки.

Опыты проводят на мышах-самцах линии СЗНА весом 18-24 г. Бензидин добавляют к основному рациону животных ежедневно из расчета 100 мг/кг веса. Скармливание канцерогена продолжают 15 дней. Эфирные масла вводят ингаляционным способом, помещая мышей в герметическую камеру. Подачу воздуха в камеру осуществляют при помощи компрессора. Перед поступлением в камеру воздух продувают через сосуд с испытуемым эфирным маслом, которое взвешивают до и после окончания срок ингаляции. Способ подачи в камеру воздуха, смешанного с летучими фракциями эфирного масла, дозируют при помощи ареометра. Скорость составляет 3 л/мин. Мышей подвергают ингаляции в течение 1 часа через день (9 раз).

Исследуют следующие группы мышей:
1. Мыши, получившие канцероген 15 дней;
2. Мыши, которым вводилось эфирное масло (без канцерогена);
3. Мыши, которые получали 15 дней бензидин и которым вводилось эфирное масло;
4. Контрольная группа интактные животные.

За 4 дня до окончания эксперимента контрольным и подопытным животным внутрибрюшинно вводят 10% взвесь эритроцитов барана (ЭБ) в количестве 0,5 мл.

Определение КБА проводят в сыворотке крови и экстрактах печени мышей.

Для получения сыворотки крови используют пул от 3-5 мышей. Для получения тканевых антигенов используют печень от каждой мыши. Тканевые экстракты печени получают путем гомогенизации ткани печени в объеме воды, равном 5-кратному весу печени. После гомогенизации экстракты оставляют на сутки в рефрижераторе при +4^oC, затем центрифугируют при 8000 об/мин и концентрируют до содержания белка в пробах 5-7г%
Определение КБА в сыворотке крови и тканевых экстрактах печени животных проводят методом двойной диффузии в агаре (Гусев А.И. Микрометод преципитации в агаре. Иммунохимический анализ. М.Медицина, 1966, с.99-113) при использовании в качестве тест-систем иммунсывороток кроликов, содержащих антитела, специфически направленные против канцерогенов как гаптенов.

Для постановки реакции применяют 1%-ный раствор агара в физиологическом растворе, консервированный фенолом (из расчета 0,25 г фенола на 0,1 л жидкости). Расплавленный агар заливают на стеклянные пластинки размером 9х12, разделенные стеклянными перегородками на три секции. На края пластинок во избежание растекания агара наклеивают бортики толщиной 2 мм и шириной 5 мм. Склеивание стекол производится эпоксидной смолой. После застывания агара при помощи латунного штампа, имеющего центральный и 6 периферических пробойников, в слое агара делают лунки. В центральную лунку заливают иммунсыворотку кроликов, содержащую антитела против канцерогена как гаптена, а в периферические сыворотки или тканевые экстракты печени подопытных и контрольных мышей. После постановки реакции пластинки помещают во влажную камеру. Результаты реакций просматривают на следующий день и фиксируют через 3-4 дня.

О присутствии в исследуемых материалах КБА судят по появлению четкой линии преципитации, образующейся при взаимодействии антител против канцерогена, содержащихся в иммунсыворотке, с канцероген-белковым антигеном, присутствующим в исследуемом материале (сыворотка крови, тканевые экстракты печени подопытных мышей), отсутствующей в реакции той же иммунсыворотки с соответствующими материалами контрольных животных.

Определение показателей иммунореактивности у экспериментальных животных.

Определение показателей иммунореактивности в группах подопытных и контрольных животных проводят путем подсчета антителообразующих B-клеток в селезенке мышей против эритроцитов барана (ЭБ) при помощи реакции локального гемолиза в геле, отражающей состояние B-системы иммунитета, и розеткообразующих T-клеток. Состояние T-системы иммунитета определялось в селезенке, тимусе и лимфоузлах при помощи реакции иммунного розеткообразования.

Для определения количества антителообразующих B-клеток мышей иммунизируют ЭБ внутрибрюшинно за 4 дня до окончания эксперимента. ЭБ вводят в дозе 5•10⁸ в 0,5 мл физиологического раствора. На 5-й день после введения ЭБ мышей забивают, извлекают селезенку и гомогенизируют ее в среде 199. Гомогенат пропускают через капроновое сито и помещают в холодильник на 30 минут. Через 30 минут из верхнего слоя берут 0,2 мл взвеси клеток, разводят в 3,8 мл среды 199. Подсчет клеток осуществляют в камере Горяева. В пробирки с подогретой на водяной бане при 50^oC агарозной средой (1,5 мл 1,4% агарозы и 1,5 мл среды 199) быстро добавляют по 0,1 мл 10% взвеси ЭБ и 0,1 мл взвеси клеток селезенки и полученной смесью заливают чашки Петри. Чашки инкубируют 1,5 часа в термостате при температуре +37^oC. После инкубации в каждую чашку добавляют комплемент в разведении 1:4 и чашки снова инкубируют в термостате в течение 1 часа. В каждой чашке подсчитывают зоны гемолиза с последующим пересчетом количества АОК на 10⁶ ядерных клеток селезенки.

Для определения количества розеткообразующих клеток органы (селезенка, тимус, лимфоузлы) иммунизированных ЭБ мышей гомогенизируют в 1 мл среды 199, фильтруя через капроновое сито, и отмывают 2 раза средой 199 при 400g в течение 5 минут. Смешивают 2 млн лимфоцитов (в 0,1 мл среды 199) с 20 млн ЭБ (1% взвесь отмытых ЭБ в 0,13 мл среды). Смесь центрифугируют при 400 g в течение 5 мин и помещают в холодильник при +4^oC на 60 мин. Надосадочную жидкость отсасывают. Готовят 0,6% глютаральдегит. В каждую пробирку осторожно добавляют 1 мл глютаральдегида. Суспензию составляют на 20 минут при +4^oC, затем центрифугируют при 400 g. Из осадка готовят мазки. Подсчитывают число РОК на 100 лимфоцитов. Статистическую обработку результатов производят при помощи t-критерия Стьюдента.

Эффективность заявляемого изобретения показана при введении мышам одновременно с канцерогеном из 6 испытанных масел (шалфейное, гвоздичное, жасминовое, анисовое, эвгеноловое и пихтовое) только двух шалфейного и гвоздичного.

Результаты испытаний шалфейного и гвоздичного масел представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, введение мышам одного канцерогена бензидина, вызывало следующие нарушения:
1) в сыворотке крови и в ткани-мишени печени животных происходило образование КБА, содержащих экзогенный канцероген бензидин, и эндогенный - 3-ОАК у всех обследованных мышей;
2) введение бензидина вызывало снижение антителообразующей функции B-клеток: число АОК в селезенке мышей, получавших бензидин (79,4) было статистически достоверно ниже, чем у контрольных мышей (274,0);
3) введение бензидина мышам вызывало у них инволюцию тимуса и снижение числа розеткообразующих T-лимфоцитов в селезенке и лимфоузлах, статистически достоверное по сравнению с группой контрольных животных.

Ингаляционное введение мышам одних эфирных масел, без канцерогена, как видно из табл. 1, не вызывало у них образования 3-ОАК-антигена ни в сыворотке крови, ни в печени животных. Шалфейное масло не обладало иммуностимулирующими свойствами: под его влиянием отмечалось незначительное снижение числа АОК в селезенке, а число розеткообразующих T-клеток в селезенке, тимусе и лимфоузлах не отличалось от соответствующих значений в контроле.

В отличие от шалфейного введения гвоздичного масла вызывало статистически достоверное по сравнению с контролем увеличение содержания как АОК, так и розеткообразующих T-лимфоцитов в селезенке, тимусе и лимфоузлах мышей.

Ингаляционное введение мышам одновременно с канцерогеном как шалфейного так и гвоздичного масел вызывало:
1) полное подавление образования как бензидин-, так и 3-ОАК-содержащих КБА, как в сыворотке крови, так и в печени животных;
2) стимуляцию образования антителообразующих B-клеток, которое не только достигло уровня в контроле, но статистически достоверно превышало его;
3) стимуляцию образования розеткообразующих T-лимфоцитов в селезенке, тимусе и лимфоузлах, количество которых было статистически достоверно выше не только соответствующих значений в группе мышей, получивших бензидин, но также достоверно превышало содержание их в группе контрольных мышей.

Для сравнения в табл. 2 и 3 приведены результаты исследований эфирных масел (анисового, жасминового, эвгенолового, пихтового), которые оказывали на образование КБА и иммунореактивность или частичный эффект, или никакого эффекта. Кроме того, введение этих масел даже без канцерогена вызывало образование у мышей 3-ОАК-антигена.

Введение жасминового эфирного масла без канцерогена вызывало стимуляцию образования антителообразующих B-клеток в селезенке мышей, статистически достоверную по сравнению с контролем, увеличение содержания T-розеткообразующих клеток в селезенке мышей и не влияло на их содержание в тимусе и лимфоузлах. Введение этого масла вызывало образование 3-ОАК-антигена в сыворотке крови мышей. При введении жасминового масла вместе с канцерогеном отмечалось подавление 3-ОАК-антигена и снижение образования бензидин-антигена в печени мышей. На образование КБА в сыворотке крови мышей это масло не влияло. Результаты исследований показателей иммунореактивности в этой группе мышей показали увеличение числа АОК, достоверное как по сравнению с группой мышей, получавших бензидин, так и по сравнению с контрольной группой животных. Число розеткообразующих T-клеток увеличивалось только в селезенке и тимусе мышей этой группы по сравнению с группой мышей, получавших один бензидин.

Введение анисового эфирного масла без канцерогена вызывало образование 3-ОАК-антигена в сыворотке крови мышей, а при введении вместе с канцерогеном практически не влияло на образование КБА, вызывая лишь незначительное снижение частоты регистрации 3-ОАК-антигена в печени мышей.

Введение одного анисового масла вызывало стимуляцию образования АОК в селезенке мышей и не влияло на число розеткообразующих T-лимфоцитов. При введении этого масла вместе с канцерогеном отмечалось благоприятное действие его только на образование АОК, которое было достоверно выше, чем у мышей, получавших один канцероген. Число розеткообразующих T-клеток в этой группе мышей было ниже, чем в контроле в селезенке и лимфоузлах, а в тимусе, так же как и у мышей, получавших один бензидин, отмечалась инволюция.

Эвгеноловое эфирное масло при его введении без канцерогена не оказывало стимулирующего действия ни на число АОК, ни на число РОК значения этих показателей были даже достоверно ниже, чем в контроле. Введение этого масла вызывало образование 3-ОАК-антигена в печени и сыворотке мышей.

При введении эвгенолового масла вместе с канцерогеном-бензидином отмечалось снижение образования КБА только в печени животных. Это масло оказывало некоторый защитный эффект на число АОК и РОК в селезенке, значения которых были выше, чем в группе мышей, получавших бензидин, но ниже, чем в контроле.

Введение пихтового эфирного масла без канцерогена вызывало образование 3-ОАК-антигена только в печени мышей в одном из 7 поставленных опытов. Это масло оказывало незначительное стимулирующее влияние только на образование АОК в селезенке мышей и не влияло на число розеткообразующих T-клеток.

Введение пихтового масла вместе с бензидином вызывало снижение образования только бензидин-антигена в сыворотке крови мышей. Это масло оказывало некоторый защитный эффект на число АОК, которое было выше, чем в группе мышей, получавших один бензидин, но ниже, чем в контроле и препятствовало инволюции тимуса число РОК в нем не отличалось достоверно от соответствующих значений в контроле.

Таким образом, из 6 испытанных препаратов биологически активных соединений растительного происхождения эфирных масел, только 2 препарата - шалфейное и гвоздичное масла тормозили полностью взаимодействие канцерогена с белками ткани-мишени печени и сывороточными белками и образование специфических маркеров канцерогенеза КБА. Эти вещества препятствовали также развитию характерных для канцерогенеза нарушений T- и B-систем иммунитета, вызываемых бензидином.

Представляет значительный интерес тот факт, что почти все испытанные препараты эфирных масел, кроме одного (анисового), препятствовали развитию инволюции тимуса, играющего важную роль в противоопухолевом иммунитете.

Представленные материалы впервые показывают в экспериментальных исследованиях возможность полного торможения взаимодействия канцерогенов с белками. Обнаружена возможность коррекции нарушений иммунореактивности, связанных с канцерогенезом, при помощи шалфейного и гвоздичного масел.

Эти экспериментальные данные явились основанием для достижения цели изобретения разработки способа повышения эффективности профилактики повышенного онкологического риска у промышленных рабочих на основе использования шалфейного и гвоздичного масел.

Цель достигается путем выполнения следующих этапов:
1. Получение тест-систем для определения КБА;
2. Выявление при помощи полученных тест-систем лиц с повышенным онкологическим риском;
3. Проведение профилактического курса ароматерапии гвоздичным и шалфейным маслами;
4. Определение эффективности ароматерапии путем повторного обследования рабочих по окончании курса введения масел.

Получение тест-систем для определения КБА, содержащих канцерогены-бензидин и 3-ОАК, проводят также, как это описано выше при проведении экспериментальных исследований по изучению действия эфирных масел на образование КБА.

В качестве тест-системы для определения КБА, содержащих другое канцерогенное для человека соединение 2-нафтиламин, используют иммунсыворотки кроликов, полученные после иммунизации их 2-нафтиламиназопротеином.

Получение 2-нафтиламин-азопротеинов проводят путем диазотирования аминогруппы 2-нафтиламина и последующего азосочетания диазосоединения 2-нафтиламина с белковым носителем.

Для диазотирования 2-нафтиламина смесь состоящую из 0,02 л H₂O, 1,43 г 2-нафтиламина и 0,37 г концентрированной HCl нагревают до 80^oC и перемешивают до полного растворения. Затем раствор быстро охлаждают до 0^oC путем добавления дробленого льда. При этом выпадает осадок. В полученную суспензию соляно-кислого 2-нафтиламина добавляют 0,37 г концентрированной HCl, 1 г концентрированной H₂SO₄ и дробленый лед, чтобы температура смеси достигла 0^oC и лед оставался в избытке. Эту смесь помещают на магнитную мешалку и при хорошем перемешивании добавляют к ней 0,7 г сухого NaNO₂. Диазотирование заканчивается через 20-30 минут. Получается диазосоединение в виде желтого раствора.

Для азосочетания используют в качестве носителя белки альбуминов лошадиной сыворотки. Азосочетание проводят в щелочной по фенолфталеину среде -pH 8-10 при температуре +4^oC. К 0,1 л раствора альбуминов лошадиной сыворотки, подщелоченному 40% раствором NaOH,до появления реакции на фенофталеин, по каплям добавляют раствор диазосоединения 2-нафтиламина и 40%-й раствор NaOH до образования малиновой окраски на фенофталеин при постоянном перемешивании реакционной среды.

Полученный азопротеин, имеющий темпно-вишневый цвет, осаждают раствором HCl 1:3, центрифугируют при 800 g/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают, а остаток растворяют в минимальном объеме раствора 0,1 NNaOH. Щелочной раствор азопротеина подвергают диализу против физиологического раствора до исчезновения окраски на фенофталеин, после чего концентрируют до 4-5г% по белку и консервируют фенолом из расчета 0,25 г фенола на 0,1 л раствора азопротеина.

Иммунизацию кроликов, получение иммунсывороток и их тестирование проводят по схеме, описанной для КБА, содержащих бензидин и 3-ОАК.

Выявление лиц с повышенным профессиональным онкологическим риском среди промышленных рабочих, имеющих производственный контакт с 2-нафтиламином и бензидином, или с производственным сырьем, содержащим эти канцерогены (красители, производство резины), проводят путем определения в сыворотке крови рабочих, взятой локтевой вены, канцероген-белковых аддуктов, содержащих эти экзогенно поступающие в организм канцерогены, и эндогенный 3-ОАК. Определение КБА проводят при помощи того же метода, который использовался и описан выше для определения КБА в сыворотке крови и тканевых экстрактах в экспериментальных исследованиях метода встречной иммунодиффузии в агаре. В качестве контроля используют сыворотки крови здоровых доноров. При постановке реакции в центральную лунки заливают иммунсыворотку кролика, содержащую антитела против канцерогена как гаптена, а в периферические сыворотки крови рабочих и доноров в качестве контроля. О присутствии в сыворотке крови рабочих КБА судят по появлению четкой линии преципитации, образующейся при взаимодействии антител против канцерогена, содержащихся в иммунсыворотке, с КБА, присутствующими в сыворотке крови рабочего, и отсутствию подобной линии с контрольной сывороткой крови донора.

Ароматерапию проводят путем ингаляционного введения рабочим смеси гвоздичного и шалфейного масел, смешанных в соотношении 1:1. Ароматерапию проводят в специально отведенном помещении комнате 40-50 м³ и групповым методом по 15-20 человек одновременно. При ароматерапии используют концентрации масел, близкие к природным, т.е. те, которые характерны для естественных условий 0,3 мг/м³ воздуха.

Распыление масла в помещении проводят при помощи пылесоса, в приставку которого помещают кубик пенопласта, на него микропипеткой наносят рассчитанное в соответствии с объемом помещения количество масла и через этот кубик прокачивают воздух в течение 10 минут. Этого времени достаточно для создания заданной концентрации эфирного масла.

Расчет количества эфирного масла для создания необходимой концентрации летучих фракций проводят следующим образом: вначале определяют объем комнаты, который затем умножают на 0,3 мг. Полученную цифру умножают еще на 2,0, так как летучие фракции составляют 50-60% эфирного масла. Например, для объема комнаты 50 м³ достаточно нанести для однократного распыления 30 мг масла. Длительность процедуры составляет 30 минут в день, курс лечения 15 процедур.

После окончания курса ароматерапии у рабочих повторно берут кровь и определяют содержание в ней КБА, используя те же тест-системы, при помощи которых КБА были обнаружены в сыворотке крови рабочих до ароматерапии.

Для лучшего понимания сущности заявляемого изобретения приведен пример его конкретной реализации.

Исследуемый контингент состоял из рабочих резиновой промышленности. Маркерами повышенного онкологического риска у этих рабочих, как показали результаты наших исследований, могут служить КБА, содержащие экзогенные канцерогены-бензидин и 2-нафтиламин, являющиеся одним из производственных факторов повышенного риска в резиновой промышленности (Коростелева Т.А. Шмидт А. В. Факторы онкологического риска и рак у рабочих резиновой промышленности. //Вопр. онкол. 1989, N 5, с.536-545), а также эндогенный канцероген 3-ОАК, регистрируемый в крови рабочих (Коростелева Т.А. Белохвостова А.Т. Потаненкова Л. С. Мовсесян К.С. Способ выявления групп риска, связанных с онкологическими заболеваниями у промышленных рабочих. Авт.св. N 1649927, 1991). Появление КБА, содержащих 3-ОАК, связано с метаболическими нарушениями, вызываемыми в организме поступлением экзогенных канцерогенов.

Для проведения ароматерапии была отобрана группа рабочих, состоящая из 50 человек с повышенным онкологическим риском, в сыворотке крови которых были обнаружены КБА, содержащие бензидин, 2-нафтиламин или 3-ОАК.

Кроме КБА, в сыворотке крови рабочих до и после ароматерапии определялось также содержание циркулирующих иммунных комплексов (ИК). Для определения количества ИК использовался метод, основанный на селективной преципитации комплексов антиген-антитело в 3,75% полиэтиленгликоле с последующим фотометрическим определением плотности преципитата (Гриневич Ю.А. Алферов Ю.Н. Определение иммунных комплексов в крови онкологических больных.//Лаб.дело, 1981, N 8, с. 493-495). Содержание ИК определялось для оценки воздействия эфирных масел на гуморальный иммунитет у рабочих, играющих важную роль в противоопухолевой защите организма.

Образование ИК антиген-антитело отражает фазу нормального иммунного ответа, направленного на удаление чужеродных веществ. Все экзо- и эндоантигены можно считать индукторами образования ИК. Предполагается также важная роль ИК в иммунорегуляции- взаимодействуя с клеточными рецепторами, ИК могут моделировать клеточный и гуморальный ответы. В кровяном русле постоянно присутствует широкий спектр циркулирующих ИК, обладающих различной структурой и биологическими свойствами. В настоящее время доказано, что такие формы патологических процессов, как инфекции, аутоиммунитет и рак протекают на фоне образования ИК. В связи с тем, что КБА являются аномальными для организма соединениями, можно ожидать, что изменения в содержании КБА в организме рабочих найдут отражение в содержании ИК.

Результаты исследования влияния ароматерапии на присутствие КБА и количество ИК у рабочих представлены в табл. 4.

Как видно из таблицы, до ароматерапии КБА, содержащие 3-ОАК, были обнаружены в крови 49 рабочих, что составило 98% содержащие бензидин у 27 из 50 рабочих (54% ), а 2-нафтиламин у 18 человек (36%). Общая группа повышенного онкологического риска составила 100% (в крови всех 50 рабочих были обнаружены КБА, содержащие 3-ОАК, бензидин или 2-нафтиламин). После ароматерапии КБА, содержащие 3-ОАК, были обнаружены у 7 человек (14,0%), бензидин у 6 (12,0%), 2-нафтиламин у одного (2,0%). Общая группа риска составила 10 человек, т.е. 20% Таким образом, после ароматерапии число рабочих, содержащих в крови 3-ОАК-антиген, сократилось в 7 раз, бензидин-антиген в 4,5 раза, а 2-нафтиламин-антиген в 18 раз. Общая группа повышенного онкологического риска (безотносительно канцерогена, входящего в состав КБА) сократилась в 5 раз.

Сокращение числа рабочих, имеющих КБА в крови, после ароматерапии согласуется с результатами определения у них количества ИК: если до ароматерапии среднее количество ИК составляло 158,1±1,07, то после ароматерапии оно снизилось до 129,8±7,7 (различия статистически достоверны).

Следует отметить, что ароматерапия не вызывала у рабочих никаких побочных явления.

При сравнении с прототипом эффективность действия ароматерапии оказалась значительно выше: введение рабочим аскорбиновой кислоты, согласно прототипу, вызывало снижение частоты регистрации в сыворотке крови рабочих только КБА, содержащих 3-ОАК, в 3 раза, в то время как после ароматерапии число рабочих, содержащих в сыворотке крови 3-ОАК-антиген, сократилось в 7 раз.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что ароматерапия смесью шалфейного и гвоздичного масел вызывает четко выраженное торможение образования у рабочих аддуктов канцерогенов с белками и может быть предложена в качестве способа профилактики повышенного онкологического риска.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для профилактики доклинических форм заболевания злокачественными новообразованиями - онкологического риска.

Цель изобретения - повышение эффективности профилактики повышенного онкологического риска среди промышленных рабочих путем использования ароматерапии смесью шалфейного и гвоздичного масел для торможения взаимодействия канцерогенов с белками и образования факторов повышенного онкологического риска - канцероген-белковых аддуктов.

Материалы заявленного изобретения впервые показывают в экспериментальных исследованиях возможность полного торможения взаимодействия канцерогенов с белками и возможность сокращения группы повышенного онкологического риска промышленных рабочих в 5 раз. Обнаружена возможность коррекции нарушений иммунореактивности, связанных с канцерогенезом, при помощи биологически активных соединений - шалфейного и гвоздичного эфирных масел. 4 табл.

Способ профилактики повышенного онкологического риска, отличающийся тем, что применяют ингаляционное введение смеси шалфейного и гвоздичного эфирных масел.