ИММУНОМОДУЛЯТОР Российский патент 2019 года по МПК A61K31/515 A61P37/02 

Изобретение относится к синтетическим иммуномодуляторам на основе циклического производного барбитуровой кислоты (1-о-фторбензоил-5-фенил-5-этил-барбитуровая кислота) и может быть использовано в качестве модулятора функциональной активности иммунной системы и ее клеточных элементов как в норме, так и при патологии.

Функциональная активность иммунной системы, и иммунокомпетентных клеток в частности, играет важную роль в организме на всех этапах онтогенеза (Ярилин А.А. Иммунология. М.: Медицина, 2013, 288 с.; Маркова Е.В. Иммунная система и высшая нервная деятельность: механизмы нейроиммунных взаимодействий в реализации и регуляции поведенческих реакций. Saarbruken, 2012, 260 с.; Маркова Е.В., Аникеева О.С. Влияние иммунокомпетентных клеток на формирование поведенческого стереотипа в онтогенезе. В мире научных открытий, 2015, №2 (62), С. 154-170; Маркова Е.В., Княжева М.А., Амстиславская Т.Г. Модуляция функциональной активности нервной системы у экспериментальных животных с агрессивно-подобным поведением трансплантацией клеток иммунной системы, обработанных in vitro нейролептиком; Российский иммунологический журнал, 2016, Т. 10 (19), №2 (1), С. 136-138). Нарушение функционирования иммунной системы является существенным звеном патогенеза многих заболеваний, оказывая негативное влияние на их течение, утяжеляя клиническую картину, снижая эффективность терапии (Маркова Е.В., Княжева М.А., Рюмина Т.В., Козлов В.А. Особенности функционирования клеток иммунной системы у особей с агрессивно - и депрессивно-подобным типами поведения. В мире научных открытий, 2014, №8 (56), С. 131-147; Idova G. V., Markova Е. V., Gevorgyan М. М., Alperina Е. L, Zhukova Е. N. Changes in Production of Cytokines by C57BI/6J Mouse Spleen during Aggression Provoked by Social Stress. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 2016, vol. 160, N. 5, P. 679-682; Маркова E.B., Савкин И.В., Климова Т.В. Нейроиммунные механизмы психосоматической патологии. Красноярск, 2017, 164 с.; Е. Markova, М. Knyazheva, I. Savkin, Т. Amstislavskaya. Psychoneuroimmunomodulating effect of immune cells treated with psychoactive drug in depressive - like animals. European Psychiatry, 2018, vol. 48, p. 293; Симбирцев A.C. Цитокины в патогенезе и лечении заболеваний человека. Издательство Фолиант, 2018, 512 с.). В патогенезе заболеваний нервной системы, сопровождающихся судорогами, а также при алкоголизме, нарушение функциональной активности иммунной системы и иммунокомпетентных клеток, в частности, также играет существенную роль (Т. Novozheeva, Е. Markova, О. Shushpanova, Е. Knyazeva, T.Shushpanova. Optimizing pharmacotherapy of epilepsy by creating new ways of administering of original anticonvulsant meta-chlorobenzhydryl urea (m-CLBHU). European psychiatry, 2019, vol. 56, p. S15; Гольдина И.А., Маркова E.B. Нейроиммунные механизмы патогенеза рассеянного склероза. Красноярск, 2018, 150 с.; Е. Markova, I. Savkin, О. Anikeeva, Т. Shushpanova. Immunomodulatory effect of original anticonvulsant meta-chloro-benzhydryl-urea in mice with experimental alcoholism. European psychiatry, 2019, vol. 56. - p. S662).

Поэтому возникает необходимость исследовать влияние известных антиконвульсантов на функцию клеточных элементов иммунной системы в норме и при патологии (алкоголизме).

Производные мочевины, такие как барбитуровая кислота и ее замещенные гомологи, являющиеся циклическими N,N'-малонилмочевинами, широко известны в качестве фармакологических препаратов. Производные барбитуровой кислоты и их ациклические аналоги, представляющие собой синтетические лиганды бензодиазепиновых рецепторов, обладают широким спектром биологической активности, в том числе являются мощными антиконвульсантами и гепатопротекторами. (Новожеева Т.П. Средства активации систем детоксикации среди циклических и линейных производных мочевины. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Томск, 1998).

В частности, фенобарбитал обладает выраженной противосудорожной активностью и сравнительно низкой острой токсичностью.

Известно применение фенобарбитуратов в качестве препаратов для внутривенного наркоза, а также как препаратов для преднаркоза при ингаляционном наркозе (Schulz D. W., MacDonald R. L. Barbiturate enhancement of GABA-mediated inhibition and activation of chloride ion conductance: correlation with anticonvulsant and anesthetic actions. Brain research, 1981, vol. 209, №. 1, p. 177-188).

Известно применение фенобарбитуратов в качестве антиконвульсантов при лечении эпилепсии, а также в качестве седативных препаратов, ноотропных пепаратов и пепаратов, снижающих внутричерепное давление, в частности при лечении сотрясений и ушибов головного мозга (Захарченко, М.Ю. Мельников И.Н., Кайргалиев Д.В. Барбитураты, бензодиазепины, анаболические стероиды: история создания, действие, анализ. Саратов: Изд-во СГТУ им. Ю.А. Гагарина, 2015, 190 с.).

Недостатком описанных фенобарбитуратов является наличие побочных эффектов при их длительном применении.

Поэтому были исследованы фенобарбитураты, которые этих недостатков не имеют.

Известно вещество 1-о-фторбензоил-5-фенил-5-этил-барбитуровая кислота (галонал), рекомендованное к медицинскому применению и промышленному выпуску в качестве противосудорожного препарата (RU 2058295, С07С 51/363, 1996; Chankvetadze В. Basic mechanisms and pre clinical assessment of antiepileptic drags in the soviet union. European Journal of Pharmacology. 1990, vol. 183, №1, p. 24). Разработана технология получения таблеток галонала для применения в качестве эпилептического средства (Прищеп Т.П. и др. Разработка технологии получения таблеток галонала и изучение их специфической активности. Фармакология, 1993, Т. XLIII, С. 16-18).

Галонал повышает нейромедиацию гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в мозге, обладая модуляторным действием на нейрональные рецепторы, в частности ГАМК_А/БД- рецепторную систему, что может являться механизмом указанных выше свойств соединения (Humar М. et al. Barbiturates directly inhibit the calmodulin/calcineurin complex: a novel mechanism of inhibition of nuclear factor of activated T cells. Molecular pharmacology, 2004, vol. 65, №. 2, p. 350-361).

Также известно применение галонала в качестве индуктора монооксигеназной системы печени, в частности при терапии отравлений и токсических поражений печени (Новожеева Т.П. и др. Влияние бензонала, галонала и галодифа на антитоксическую функцию печени крыс при внепеченочном холестазе. Химико-фармацевтический журнал. 2004, Т. 38, №1, С. 3-4).

Учитывая наличие функциональных ГАМК_А рецепторов на поверхности клеток иммунной системы, в частности, Т-лимфоцитов (Alam S. et al. Human peripheral blood mononuclear cells express GABAA receptor subunits. Molecular immunology, 2006, vol. 43, №. 9, p. 1432-1442; Девойно Л.В., Идова Г.В., Альперина Е.Л. Психонейроиммуномодуляция: поведение и иммунитет. Роль" нейромедиаторной установки мозга", Новосибирск: Наука, 2009,. 168 с; Mendu S. K. et al. Increased GABAA channel subunits expression in CD8+ but not in CD4+ T cells in BB rats developing diabetes compared to their congenic littermates. Molecular immunology, 2011, vol. 48, №. 4, p. 399-407), можно предположить, что галонал, аналогично эффектам на нейрональных клетках, может вызывать модуляцию функциональной активности клеток иммунной системы.

С целью расширения арсенала синтетических средств, обладающих иммуномодулирующими свойствами, предлагается использовать 1-о-фторбензоил-5-фенил-5-этил-барбитуровую кислоту в качестве иммуномодулятора, в том числе при хроническом алкоголизме.

Сущность изобретения заключается в том, что при изучении влияния 1-о-фторбензоил-5-фенил-5-этил-барбитуровой кислоты (галонал) на пролиферативную активность клеток иммунной системы в норме и при патологии (хронический алкоголизм) in vivo и in vitro, равно как и на интенсивность гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа показан иммуномодулирующий эффект.

В работе использовали половозрелых мышей-самцов (СВА × C57BI/6)F1 здоровых и в состоянии хронического алкоголизма. Экспериментальные животные были получены из одного питомника и рандомизированы по возрасту и массе тела. До и в период проведения эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии, в одинаковых условиях в стандартных пластиковых клетках 40×20×20 не более 10 особей в клетке с подстилкой из мелкой древесной стружки на стандартном рационе и при нормальном световом режиме. Все исследования проводились в одно и то же время суток (с 10 до 14 часов). Исследования проводились в соответствии с правилам, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986), и правилами лабораторной практики (приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003, N267).

Пример 1. Определение влияния галонала на функциональную активность клеток иммунной системы в норме in vitro.

Изучение влияния галонала на функциональную активность клеток иммунной системы в норме проводили in vitro добавлением соединения в культуральную среду при тестировании спонтанной и митогениндуцированной пролиферативной активности лимфоидных клеток селезенки, взятых от интактных (здоровых) мышей. Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки, очищали их от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640 (5 мл на селезенку). Выделенные селезенки измельчали при помощи ножниц. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток селезенки осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток; центрифугировали 8 мин при 150 д. После удаления надосадочной жидкости, находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI - 1640. Жизнеспособность клеток определяли при помощи окраски трипановым синим.

Пролиферативный ответ лимфоидных клеток селезенки оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов. Суспензию клеток в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES-буфера (Sigma), 5×10-5М 2-меркаптоэтанола (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина вносили в объеме 50 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты (Linbro) в концентрации 10⁵ спленоцитов на лунку. К суспензии добавляли: галонал (10 мкг/мл); субоптимальные концентрации ЛПС E.coli 055:В5 (Sigma) и конкавалина A (Pharmacia), которые составляли соответственно 20 мкг/мл и 3 мкг/мл и/или культуральную среду до полного объема 150 мкл на лунку. Клетки культивировались в течение 72 часов при 37°С и 5% содержании CO2 в атмосфере. За 16 часов до окончания инкубационного периода вводили Н3-тимидин (1 мкКюри на лунку). По окончании инкубационного периода клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата «Harvester» (TITERTEK). Фильтры помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США). Пролиферативный ответ лимфоидных клеток селезенки оценивали по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки. Оценка данных проводилась как в абсолютных значениях (имп/мин), так и относительных индексах пролиферации: (Имп(Образец)/Имп(спонтанная пролиферация)). Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Спонтанная и митогениндуцированная пролиферативная активность лимфоидных клеток селезенки здоровых мышей при добавлении в культуральную среду галонала (представлены средние значения пролиферативной активности в имп/мин и индексы пролиферации).

Примечание: n=10-12 животных на каждую точку эксперимента;

* - статистически значимое различие (р<0,01) по сравнению с показателем спонтанной пролиферации; ≠ - статистически значимое различие (р<0,01) по сравнению с показателем индуцированной соответствующим митогеном пролиферации.

Результаты, представленные в таблице 1, демонстрируют модулирующий эффект галонала на пролиферативную активность лимфоидных клеток селезенки интактных (здоровых) мышей, а именно, снижение спонтанной пролиферации иммунных клеток, усиление стимулирующего пролиферацию действия Т-клеточного митогена (Конканавалин А) и снижение эффекта В-клеточного митогена (ЛПС).

Пример 2. Определение влияния галонала на функциональную активность клеток иммунной системы при патологии (хроническом алкоголизме) in vitro.

Изучение влияния галонала на функциональную активность клеток иммунной системы при патологии (хроническом алкоголизме) проводили in vitro добавлением соединения в культуральную среду при тестировании спонтанной и Т-митогениндуцированной пролиферативной активности лимфоидных клеток селезенки, взятых у мышей в состоянии хронического алкоголизма. Для моделирования хронического алкоголизма у мышей-самцов (СВА × C57BI/6)F1 животные в течение 6 месяцев подвергались принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости). Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки, очищали их от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640 (5 мл на селезенку). Выделенные селезенки измельчали на мельчайшие кусочки при помощи ножниц. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 мин при 150 g. После удаления надосадочной жидкости, находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI - 1640. Жизнеспособность клеток определяли при помощи окраски трипановым синим.

Пролиферативный ответ лимфоидных клеток селезенки оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов. Суспензию клеток в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES-буфера (Sigma), 5×10-5М 2-меркаптоэтанола (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина вносили в объеме 50 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты (Linbro) в концентрации 10⁵ спленоцитов на лунку. К суспензии добавляли: галонал (10 мкг/мл); субоптимальную концентрацию конканавалина А (Кон A) (Pharmacia), которая составляла 3 мкг/мл и/или культуральную среду до полного объема 150 мкл на лунку. Клетки культивировались в течение 72 часов при 37°С и 5% содержании CO2 в атмосфере. За 16 часов до окончания инкубационного периода вводили Н3-тимидин (1 мкКю на лунку). По окончании инкубационного периода клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата «Harvester» (TITERTEK). Фильтры помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США). Пролиферативный ответ спленоцитов оценивали по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки. Оценка данных проводилась как в абсолютных значениях (имп/мин), так и относительных индексах пролиферации: (Имп(Образец)/Имп(спонтанная пролиферация)). Результаты, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Спонтанная и митогениндуцированная пролиферативная активность лимфоидных клеток селезенки мышей в состоянии хронического алкоголизма при добавлении в культуральную среду галонала (представлены средние значения пролиферативной активности в имп/мин и индексы пролиферации).

Примечание: n=10-12 животных на каждую точку эксперимента

* - статистически значимое различие (р<0,01) по сравнению с показателем спонтанной пролиферации при хроническом алкоголизме; ≠ - статистически значимое различие (р<0,01) по сравнению с показателем митогениндуцированной пролиферации при хроническом алкоголизме; + - .статистически значимое различие (р<0,01) по сравнению с интактным контролем (соответствующим показателем у здоровых животных).

Как видно из таблицы 2, при хроническом алкоголизме лимфоидные клетки селезенки отличаются нарушенной функциональной активностью, проявляющейся в их низкой чувствительности к Т-клеточному митогену. Результаты, представленные в таблице 2, также демонстрируют способность галонала в 3,9 раза повышать чувствительность лимфоидных клеток селезенки к стимулирующему действию Т-клеточного митогена.

Пример 3. Определение влияния галонала на функциональную активность лимфоидных клеток селезенки при патологии (хроническом алкоголизме) in vitro в присутствии гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК).

Принимая во внимание тот факт, что исследуемое соединение, как указано выше, образует на поверхности лимфоцитов функциональный комплекс с ГАМК_А-рецепторами, опосредующий эффекты этанола, было исследовано влияние галонала на пролиферативную активность лимфоидных клеток селезенки in vitro при добавлении в культуральную среду ГАМК.

Изучение влияния галонала на функциональную активность клеток иммунной системы in vitro в присутствии ГАМК проводили добавлением соединения в культуральную среду при тестировании спонтанной пролиферативной активности клеток селезенки, взятых у мышей в состоянии хронического алкоголизма.

Для моделирования хронического алкоголизма у мышей-самцов (СВА × C57BI/6)F1 животные в течение 6 месяцев подвергались принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости). Животных забивали путем цервикальной дислокации; в стерильных условиях вскрывали брюшную полость, извлекали селезенки, очищали их от соединительной ткани и помещали во флаконы с охлажденной до 4°С средой RPMI-1640 (5 мл на селезенку). Выделенные селезенки измельчали на мельчайшие кусочки при помощи ножниц. Образовавшуюся в результате измельчения суспензию клеток осторожно ресуспензировали с помощью шприца, для того, чтобы распались оставшиеся скопления клеток, центрифугировали 8 мин при 150 g. После удаления надосадочной жидкости, находящиеся в осадке спленоциты ресуспензировали в среде RPMI - 1640. Жизнеспособность клеток определяли при помощи окраски трипановым синим.

Пролиферативный ответ лимфоидных клеток селезенки оценивали общепринятым методом реакции бластной трансформации лимфоцитов. Суспензию клеток в полной культуральной среде, содержащей RPMI-1640, 5% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES-буфера (Sigma), 5×10-5М 2-меркаптоэтанола (Sigma) и 80 мкг/мл гентамицина вносили в объеме 50 мкл в 96-луночные круглодонные планшеты (Linbro) в концентрации 10⁵ спленоцитов на лунку. К суспензии добавляли: ГАМК (10 мкг/мл) изолированно и в присутствии галонала (10 мкг/мл). Клетки культивировались в течение 72 часов при 37°С и 5% содержании CO2 в атмосфере. За 16 часов до окончания инкубационного периода вводили Н3-тимидин (1 мкКю на лунку). По окончании инкубационного периода клетки собирали на стеклянно-волокнистые фильтры (Flow Lab) с помощью аппарата «Harvester» (TITERTEK). Фильтры помещали во флаконы для сцинтилляционного счета, и радиоактивность подсчитывали в сцинтилляторе (4 г дифенилоксазола и 0,1 г дифенил-оксазолилбензола на 1 л толуола) в жидкостном сцинтилляционном счетчике «Delta» (США). Пролиферативный ответ лимфоидных клеток селезенки оценивали по включению в нуклеопротеидные фракции клеток радиоактивной метки. Оценка данных проводилась как в абсолютных значениях (имп/мин), так и относительных индексах пролиферации: (Имп(Образец)/Имп(спонтанная пролиферация)). Результаты, представлены в таблице 3.

Таблица 3. Пролиферативная активность лимфоидных клеток селезенки мышей в состоянии хронического алкоголизма при добавлении в культуральную среду галонала и ГАМК (представлены средние значения пролиферативной активности в имп/мин и индексы пролиферации).

Примечание: n=10-12 животных на каждую точку эксперимента;

* - статистически значимое различие (р<0,01) по сравнению с показателем спонтанной пролиферации при хроническом алкоголизме; ≠ - статистически значимое различие (р<0,01) по сравнению с показателем пролиферации лимфоидных клеток селезенки в присутствии ГАМК.

Результаты, представленные в таблице 3, демонстрируют повышение галоналом пролиферативной активности лимфоидных клеток селезенки в присутствии ГАМК при хроническом алкоголизме. Это свидетельствует в пользу того, что галонал, аналогично эффектам на нейрональных клетках, вызывает модуляцию функциональной активности клеток иммунной системы через прямое воздействие на ГАМК_А/БДР рецептурную систему на поверхности лимфоцитов.

Пример 4. Определение влияния галонала на интенсивность гуморального иммунного ответа при патологии (хронический алкоголизм) in vivo.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма у мышей-самцов (СБА × C57BI/6)F1 животные в течение 6 месяцев подвергались принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости). Затем животные подвергались курсовому (10 дней), введению галонала в действующей концентрации 100 мг/кг массы тела в сутки в виде суспензии на 1% крахмальной слизи внутрижелудочно, по окончании которого оценивалась интенсивность гуморального иммунного ответа по количеству антителообразующих клеток селезенки (АОК). Определение количества АОК проводилось модифицированным методом A.J. Cunningham (Cunningham A.J. А method of increased sensitivity for detecting single antibody-forming cells. Nature, 1965, N 207, P. 1106-1107) на 5-е сутки после внутрибрюшинной иммунизации Т-клеточным антигеном эритроцитами барана (ЭБ) по количеству локальных зон гемолиза в полужидкой среде. Для этого селезенку измельчали ножницами в бюксе со средой 199, взвесь кусочков ткани несколько раз пропускали с помощью шприца через стальную иглу. Полученную суспензию клеток фильтровали. Конечный объем суспензии доводили до 5 мл. Работы проводили при температуре +4°С. Равные объемы клеточной суспензии, 10% суспензии ЭБ и раствора комплемента смешивали в бюксе и заливали в стеклянные камеры. Камеры были изготовлены следующим образом: между двумя предметными стеклами прокладывали полоску бумаги, а верхние и нижние края склеивали между собой горячим парафином. Когда парафин остывал, полоску бумаги вынимали и в щель между стеклами шприцем заливали смесь из 0,5 мл клеточной суспензии, 0,5 мл ЭБ (10% суспензии) и 0,5 мл комплемента. Комплемент готовили непосредственно перед заливкой камеры. Учитывали объем суспензии, залитой в камеры. Заполненные камеры инкубировали в течение 45 минут в термостате при температуре 37°С. После инкубации подсчитывали количество локальных зон гемолиза в камере под бинокулярной лупой (увеличение в 20 раз). Зона гемолиза (бляшка) представляет собой округлый участок, почти полностью свободный от эритроцитов. Учитывая число бляшек в камере, количество ядросодержащих клеток в 1 мл клеточной суспензии, объем заполненной камеры и клеточность селезенки. Подсчет ядросодержащих клеток селезенки производили в камере Горяева. Оценивали относительное (на 10⁶ ядросодержащих клеток селезенки) число АОК.

В качестве контроля использовались здоровые животные соответствующего возраста, которые содержались с экспериментальной группой мышей в аналогичных условиях, но не принимали алкоголь.

После курсового (10 дней) введения галонала у животных в состоянии хронического алгкоголизма регистрировалось повышение гуморального иммунного ответа, оцененное по относительному числу антителообразующих клеток селезенки.

На рисунке 1 представлен гуморальный иммунный ответ мышей (CBA×C57BI/6)F1 в состоянии хронического алкоголизма и после курсового приема галонала: по оси ординат отображено относительное количество антителообразующих клеток селезенки (на 10⁶ ядросодержащих клеток селезенки). 1-я группа столбиков (светлые столбики) - контрольная группа здоровых животных; 2-я группа столбиков (темные столбики) - животные в состоянии хронического алкоголизма; 3-я группа столбиков (серые столбики) - животные в состоянии хронического алкоголизма после курсового приема галонала.

n=12-15 в каждой группе животных.

р<0,01 - между мышами в состоянии хронического алкоголизма и контрольной группой здоровых животных;

р<0,01 между мышами в состоянии хронического алкоголизма до и после курсового приема галонала.

Таким образом, сниженный при хроническом алкоголизме гуморальный иммунный ответ в результате курсового приема галонала повышается до уровня, характерного для здоровых животных соответствующего возраста.

Пример 5. Определение влияния галонала на интенсивность клеточного иммунного ответа при патологии in vivo.

Для моделирования патологии в виде хронического алкоголизма у мышей-самцов (СВА × C57BI/6)F1 животные в течение 6 месяцев подвергались принудительной алкоголизации (10% раствор этанола в качестве единственного источника жидкости). Затем животные подвергались курсовому (10 дней), введению галонала в действующей концентрации 100 мг/кг массы тела в сутки в виде суспензии на 1% крахмальной слизи внутрижелудочно, по окончании которого оценивалась интенсивность клеточного иммунного ответа по выраженности развиваемой реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ответ на введение Т-зависимого антигена - эритроцитов барана (ЭБ). Для этого мышей иммунизировали внутрибрюшинным введением ЭБ (0,5% - 0,5 мл.). Разрешающую дозу указанного антигена (50% - 0,05 мл.) вводили под апоневроз задней стопы через 96 часов. Формирование реакции ГЗТ оценивали через 24 часа после разрешающей инъекции по степени опухания лапы (изменения ее толщины по сравнению с позитивно-контрольной задней лапой того же животного, в которую была введена среда RPMI- 1640). Индекс реакции (ИР) определяли для каждой мыши по формуле ИР=(Ро - Рк) / Рк и выражали в процентах (Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto Т., et al. Effect of stimulation and blockade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad reaction to SRBC in mice. Immunol., 1979, vol. 38, N.3, p. 577-583).

В качестве контроля использовались здоровые животные соответствующего возраста, которые содержались с экспериментальной группой мышей в аналогичных условиях, но не принимали алкоголь.

После курсового (10 дней) внутрижелудочного введения галонала у животных в состоянии хронического алкоголизма регистрировалось значительное повышение клеточного иммунного ответа, оцененное по выраженности (уровню) развития реакции ГЗТ.

На рисунке 2 представлен уровень развития реакции ГЗТ у мышей (CBA×C57BI/6)F1 в состоянии хронического алкоголизма и после курсового приема галонала: по оси ординат отображен индекс реакции (%);

1-я группа столбиков (светлые столбики) - контрольная группа здоровых животных; 2-я группа столбиков (темные столбики) - животные в состоянии хронического алкоголизма; 3-я группа столбиков (серые столбики) - животные в состоянии хронического алкоголизма после курсового приема галонала.

n=15 в каждой группе животных.

р<0,01- между мышами в состоянии хронического алкоголизма и контрольной группой здоровых животных;

р<0,01 между мышами в состоянии хронического алкоголизма до и после приема галонала.

Таким образом, сниженный при хроническом алкоголизме клеточный иммунный ответ в результате курсового приема галонала повышается до уровня, характерного для здоровых животных соответствующего возраста.

Оценивая в целом результаты, можно утверждать, что галонал в физиологических дозах, оказывает иммуномодулирующий эффект, определяемый состоянием организма. У здоровых особей галонал снижает спонтанную пролиферативную активность лимфоидных клеток иммунной системы, усиливает действие Т-клеточного митогена и снижает эффект В-клеточного митогена на пролиферативную активность лимфоцитов. При патологии (экспериментальный хронический алкоголизм) галонал повышает спонтанную пролиферативную активность лимфоцитов и повышает их сниженную чувствительность к Т-клеточному митогену; при этом повышается сниженный иммунный ответ. Показатели гуморального и клеточного иммунного ответа изменяются до уровня, характерного для здоровых особей, что свидетельствует о восстановлении под действием галонала функциональной активности иммунной системы и ее клеточных элементов при алкоголизме.

Изобретение относится к синтетическим иммуномодуляторам. Предложено применение циклического производного барбитуровой кислоты (1-о-фторбензоил-5-фенил-5-этил-барбитуровая кислота) - галонала в качестве иммуномодулятора. Технический результат: галонал повышал пролиферативную активность лимфоидных клеток селезёнки и выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа. Изобретение может быть использовано в качестве модулятора функциональной активности иммунной системы и ее клеточных элементов как в норме, так и при патологии (хронический алкоголизм). 2 ил., 3 табл., 5 пр.

Применение 1-о-фторбензоил-5-фенил-5-этил-барбитуровой кислоты в качестве иммуномодулятора.