Способ определения концентрации аминогликозидного антибиотика Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/04 

(21 ) 4064921/28-13

(22) 29.04.86

(46) 23.03.88, Бнш. № 11

(71.) Государственный научно-исследовательский институт по стандартиза ции и контролю лекарственных средств

(72) С.П.Катруха, Н.С.Евтушенко

и М.П.Кудрявцева

(53)615.9.90(088.8)

(56) J. Chin.chem. 25/7, 1979, р.1222-1225.

J.Chromatogr. 298, 1984, р.443-457.

Amer.J.Clin.Phathol., 7, 1979, р.428-432.

(54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АМШЮГЛЖОЗИДНОГО АНТИБИОТИКА (57} Изобретение относится.к биотехнологии и может быть использовано

для качественной и количественной характеристик стандартов, субстанций и лекарственных форм аминогликозид- ных антибиотиков. Цель изобретения - повьиение точности способа, которая достигается тем, что раствор антибиотика основания смешивают в соотношении 1:4 с раствором фенилизотиоци анатом (ФИТЦ) в ацетонитриле , реакционную пробу инкубируют при 68-72 С в течение 10-12 мин. После охлаждения до комнатной температуры полученное фенилкарбонильное производное хроматографируют на силикагеле с обращенной фазой , а элюцию проводят в зависимости от времени от начала элюции возрастающей концентрации с 53 до 98% ацетонитрила в фосфатном буфере рН 6,9.

(Л

со

00 ND

00 41 QO

Изобретение относится к биотехно- |логии и может быть использовано для качественной и количественной харак теристик стандартов, субстанций и ле- карственных форм аминогликозидных антибиотиков, в том числе для обнаружения в исследуе мых образцах примесей известнойи неизвестной структуры.

Целью изобретения является повыше- |ние точности способа. I Пример.К 50 мкл рабочего I раствора канамицина А основания добав |ляют 200 мкл раствора фенилизотиоциа- ната (ФИТЦ) в ацетонитриле (50 мкл ФИТЦ в 1 мл ацетонитрила) и инкубируют при 70°С в течение 10 мин. После охлаждения до комнатной температуры к реакционной смеси добавляют 750 мкл 50%-ного аЦетонитрила и алик- воту наносят на колонку хроматографа, 4,6x250 мм, заполненную Zornax ODS, 5 мкм. В течение первых 4 мин элюцию ведут подвижной фазой, состоящей из 53% ацетонитрила и 47% 0,03 М фос- I фатного буфера рН 6,9. Начиная с 5 I по 10 мин, концентрацию ацетонитрила в подвижной фазе увеличивают до 98%. Скорость элюции 1 мл/мин, петля в инжекторе 10 мкл, детектирование про : изводных фенилтиокарбонила (ФТК) осуществляют с помощью ультрафиолетовог ; детектора при 254 нм, скорость ленты : на самописце 0,5 см/мин. Обработку i хроматографических данных проводят по площадям пиков. За 10 мин при 70°С происходит практически количественная модификация всех аминогрупп антибиотика (в канамицине А четыре аминогруппы). Это положение подтверждается н аличием на хроматограмме незначительных пиков, соответствующих продуктам частичного замещения (с временами выхода между 2,57 и 3,12 мин). Суммарная площадь этих пиков составляет 1,9%. Площадь пика полностью замещенного производного (время выхода 3,60 мин) составляет И9, т.е. достигается мак симальное значение.

Пример 2.К 50 мкл раствора тобрамицина основания концентра)дией 5 мг/мл добавляют раствор ФИТЦ, и модификацию и хроматографию ФТК-про- изводного антибиотика проводят так же, как описано для канамицина А в примере 1. В контрольном опыте раствор тобрамицина заменяют дистиллированной водой..

В аналитическом опыте по сравнению с контрольным на хроматограмме получают только один пик производного ФТК со временем выхода 8,59 мин, что свидетельствует о 100%-ной модификации всех пяти аминогрупп антибиотика. При калибровке прибора установлена линейная зависимость между площадями пиков на хроматограмме и концентрацией антибиотика в растворах в пределах концентраций 0,1-5 мг/мл.

11 р и м е р 3. Показана принципиальная возможность определения сизомицина и гентамицина в лекарственных формах и стандарта.х. Растворы сизомицина сульфата и гентамицина концентрацией 5 мг/мл обрабатывают таким же образом, как и канамицин А. Время выхода ФТК-сизомицина 11 ,73 ми В случае гентамицина на хроматограмме обнаруживают три пика с временами выхода 11,24, Jl,69 и 12,35 мин. Пик 11,24 мин неоднородный, с раздвоением, что указывает на присутствие двух ФТК-производных. Полученная картина разделения ФТК-гентамицина свидетельствует об обнаружении в нем четырех веществ, что согласуется с известным положением, что препарат гентамицина состоит из четырех компонентов - С,, С, С-г, С,.

Предлагаемый способ определения аминогликозидных антибиотиков прост и не требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Вьшолнение анализов занимает не более 45 мин. Метод позволяет проводить качественный и количественный анализы основного компонента лекарственной формы, определять наличие примесей и идентифицировать отдельные компоненты сложных лекарственных форм.

Формула изобретения

Способ определения концентрации аминогликозидного антибиотика путем модификации основания антибиотика по аминогруппам с последующим разделением полученного производного на колонке с обращенной фазой методом жидкостной хроматографии, элюции смесью ацетонитрила и фосфатносолевого буфера и определения концентрации антибиотика, отличающийся тем, что, с целью повышения точности

3 13828494

способа, основание антибиотика моди- биотика проводят на силикагеле с обфицируют в соотношении 1:4 по объемуращенной фазой С , а элюцию провофенилизотиоцианатом в среде ацетонит-дят при нейтральном значении рН, при

рил - вода при 68-72 С в течение этом концентрацию ацетонитрила в

10-12 мин, разделение полученногоэлюирующей смеси повьппают с 4 до

фенилкарбонильного производного анти-10 мин с 53 до 98%.