СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОГЛИКОЗИТНЫХ АНТИБИОТИКОВ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ Российский патент 2004 года по МПК G01N27/333 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения концентрации аминогликозидных антибиотиков в исследуемых жидких средах, например, для токсикологического и технического анализа лекарственных средств, в медицине для определения концентрации антибиотика в биосистемах (сыворотке крови и др) с целью регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний, при исследовании фармакокинетики и др.

Известны различные методы определения гентамицина в исследуемых средах: микробиологические, например, диффузии в агар, метод серийных разведений; спектрофотометрические, хроматографические, например, высокоэффективная жидкостная хроматография.

Микробиологические способы определения аминогликозидных антибиотиков в биологических жидкостях основаны на бактерицидном действии антибиотиков в отношении высокочувствительных микроорганизмов, помещенных в агар-агар и на визуальной регистрации аналитического сигнала (Карпов В.Л. Определение аминогликозидных антибиотиков в биологических жидкостях //Антибиотики. - 1984. -№9. - С.695-703; Государственная фармакопея СССР.- М., 1987, вып. 1, С.42-44). Например, в известном биологическом способе экспрессного определения антибиотиков используют тест-культуры, в качестве которых выбирают споры термофильных бактерий. Исследуемый материал титруют в пластинах для иммуноферментного анализа в цветной питательной среде с индикатором. В лунки пластин добавляют споры тест-культуры, посевы инкубируют при определенной температуре, а наличие антибиотика в исследуемом материале определяют по изменению цвета среды (Патент РФ №2188421, MПК G 01 N 33/48).

Микробиологические способы широко распространены, просты и не требуют дорогостоящего оборудования. Кроме того, они обеспечивают удовлетворительную чувствительность и точность при терапевтических концентрациях аминогликозидов в исследуемых средах. Однако они характеризуются длительностью анализа, зависимостью аналитического сигнала от свойств антибиотика (его растворимости, молярной массы и т.п.), не связанных с его активностью, чувствительностью тест-культур к качеству агара, используемого в способе.

Спектрофотометрическое определение аминогликозидных антибиотиков основано на образовании окрашенных соединений с азокрасителями, другими реагентами (Мухамедзянов P.M., Лиходед В.А. Метод количественного определения гентамицина сульфата//Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т. 36. - №7. - С.14-16). Известен способ определения концентрации антибиотиков в биологических жидкостях, в основе которого лежит реакция взаимодействия антибиотика с 2% раствором азокрасителя кислотного черного специального в кислой среде (рН 2,1). В результате реакции образуется трудно растворимое соединение, которое отделяют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10-15 мин. Параллельно проводят контрольную пробу, содержащую все указанные выше реагенты, кроме антибиотика. Затем измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости контрольной пробы на фоне исследуемой при λ575 нм на спектрофотометре СФ-46. В связи с тем, что в биологических жидкостях присутствуют эндогенные вещества, мешающие определению, пробы предварительно фильтруют путем их пропускания через сефодекс G-15. Концентрацию антибиотика определяют по градуировочному графику или методом добавок. (Сипливая Л.Е., Шевцова Е.М., Лазарев А.И., Прокопенко Л.Г. Иммуномодулирующее действие аминогликозидных антибиотиков при различных технологиях введения //Антибиотики и химиотерапия. - 1999. - т.44. - №2. - С.29-32.).

Способ характеризуется сложностью из-за наличия ряда дополнительных операций, длительностью его осуществления и низкой воспроизводимостью результатов анализов.

Известен способ количественного определения антибиотиков с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий предварительное получение 2,4-динитрофенильных производных (ДНФ-производных) по свободным аминогруппам антибиотиков. Образующиеся в результате реакции ДНФ-производные аминогликозидов обладают высоким удельным поглощением, что позволяет использовать для их определения ультрафиолетовый детектор. Данный способ предназначен для определения аминогликозидных антибиотиков в биологических жидкостях. (Рубашева Л.М., Лаврова М.Ф., Бражникова М.Г. Количественное определение антибиотика тобрамицина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии//Антибиотики. - 1983.- №4.- С.254-258; Фирсов А.А., Алексеева М.Е. и др. Фармокинетический мониторинг при лечении аминогликозидами: оптимальный способ индивидуализации дозирования гентамицина и сизоницина//Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - Т.36. - №10. - С.40-42).

Высокоэффективная жидкостная хроматография требует использования дорогостоящего оборудования, высококвалифицированных операторов. Кроме того, способы отличаются длительностью и требуют применения стандартов антибиотиков.

Известен способ количественного определения левомицетина в пищевых продуктах и фармпрепаратах, в котором левомицетин переводят из пробы в раствор, проводят кислотный гидролиз и осаждают белок из гидролизата с последующим вольтамперометрическим определением левомецитина в безбелковом гидролизате путем регистрации катодных пиков антибиотика на индикаторном ртутно-пленочном или стеклоуглеродном электродах. Концентрацию левомецитина определяют по высоте пика методом добавок аттестованных смесей. (Патент РФ №2180748, МПК G 01 N 27/48).

Однако для реализации данного способа требуется дорогостоящее оборудование и наличие специальной лаборатории из-за применения высокотоксичного вещества - ртути. При использовании твердого стеклоуглеродного электрода результаты отличаются низкой воспроизводимостью в связи с тем, что не происходит постоянного обновления рабочей поверхности электрода. При этом требуется сложная пробоподготовка биосистем, что значительно увеличивает длительность анализа.

К числу наиболее перспективных методов количественного определения антибиотиков относится потенциометрический способ с использованием ионоселективных электродов.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является ионометрический способ количественного определения антибиотиков в исследуемых средах, заключающийся в приготовлении растворов антибиотика и измерении ЭДС среды с использованием электродов, чувствительных к антибиотикам пенициллинового и тетрациклинового ряда и сравнительного хлоридсеребряного электрода. Для количественного определения антибиотиков используют способ градуировочного графика или стандартных добавок (Гранжан А.В., Чарыков А.К. Применение ионоселективных электродов в фармацевтическом анализе (обзор) //Хим.-фарм. журнал. - 1993.- Т.27, №7 - С.51-56).

Метод ионометрии отличается экспрессностью, селективностью, низкими пределами обнаружения определяемых веществ. Однако данный способ предназначен только для определения антибиотиков пенициллинового и тетрациклинового ряда и не может быть распространен на другие группы антибиотиков.

Задачей изобретения является расширение функциональных возможностей способа за счет расширения спектра исследуемых объектов – аминогликозидных антибиотиков, например, гентамицина в лекарственных формах и биологических жидкостях.

Поставленная задача решается тем, что в способе количественного определения аминогликозитных антибиотиков в лекарственных и биологических средах, заключающемся в приготовлении пробы, помещении ее в электрохимическую ячейку, измерении ЭДС, последующем введении добавки стандартного раствора соответствующего антибиотика и повторном измерении ЭДС и определении количества антибиотика на основе сравнения измеренных параметров ЭДС по расчетной формуле, при этом измерение ЭДС осуществляют сравнительным хлоридсеребряным электродом и индикаторным электродом с пластифицированной поливинилхлоридной мембраной, согласно изобретению перед измерениями ЭДС индикаторный электрод предварительно кондиционируют в эталонной среде, а мембрану индикаторного электрода изготавливают на основе ионного ассоциата гентамицин-тетрафенилборат, в качестве пластификатора используют дибутилфталат, который вводят в поливинилхлорид до получения эластичной пленки, при этом концентрация гентамицин-тетрафенилбората составляет 0,4-0,7%.

Пробу исследуемой среды, содержащую биологическую жидкость, предварительно центрифугируют до отделения форменных элементов жидкости, а в качестве эталонной среды используют биологическую жидкость без содержания антибиотика, при этом кондиционирование индикаторного электрода осуществляют в течение 20-30 мин.

Пробу исследуемой среды, содержащей лекарственную форму, готовят путем растворения навески препарата в дистиллированной воде, в качестве эталонной среды используют 10^-3М раствор антибиотика, при этом индикаторный электрод кондиционируют в течение 20-26 часов.

Способ заключается в следующем.

Сначала готовят электродно активное вещество - ионный ассоциат гентамицин-тетрафенилборат, получают поливинхлоридную пластифицированную дибутилфталатом мембрану, затем изготавливают ионоселективный электрод, который калибруют по стандартным растворам антибиотика, например, гентамицина. Содержание антибиотика в исследуемой среде определяют методом стандартных добавок. Для этого готовят водный раствор исследуемого лекарственного препарата или биологическую жидкость, например, сыворотку крови с помощью центрифугирования цельной венозной крови. В исследуемую среду погружают индикаторный и хлоридсеребряный электроды и измеряют ЭДС с помощью иономера. Затем в исследуемую среду вводят добавку стандартного раствора антибиотика и снова измеряют ЭДС. Добавку подбирают таким образом, чтобы величина ЭДС изменилась приблизительно на 20-30 мВ. Перед измерениями ЭДС индикаторный электрод предварительно кондиционируют в эталонных средах. Концентрацию антибиотика в исследуемом растворе рассчитывают по следующей формуле:

где С_х - концентрация определяемого вещества, М;

V_x - объем пробы, мл;

С_д- концентрация добавки, М;

V_д - объем добавки, мл;

E₁, Е₂ - потенциал электродов в исследуемом растворе и в растворе с добавкой соответственно, мВ;

S - угловой коэффициент электродной функции, мВ/рС.

Пример реализации способа 1.

Синтез электродноактивного вещества гентамицин-тетрафенилборат осуществляли следующим образом. Смешивали эквимолярные количества растворов тетрафенилбората натрия (С=1·10^-2 М, V=60 мл) и гентамицина сульфата (С=1·10^-2 М, V=20 мл) при комнатной температуре. Образовавшийся осадок отстаивали в течение 3 суток, отфильтровывали на фильтровальной бумаге с “синей лентой”. Полученный осадок электродноактивного вещества на фильтре высушивали в сушильном шкафу при 40-50°С.

Полученный таким образом ионный ассоциат гентамецицин-тетрафенилбората является малорастворимым соединением (произведение растворимости равно pK_s=9,10).

Затем изготавливали мембрану с электродноактивным веществом гентамицин-тетрафенилборат по следующей технологии.

В бюкс емкостью 10 мл помещали 1,1532 г или 66,2% дибутилфталата, 3 мл тетрагидрофурана и при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и небольшом нагревании 50-60°С добавляли 0,01111 г или 0,6% соединения гентамицин-тетрафенилборат и 0,5766 г или 33,2% поливинилхлорида. Перемешивание продолжали до полной гомогенизации смеси. Мембранную композицию выливали в чашку Петри диаметром 57 мм и оставляли на воздухе до полного удаления тетрагидрофурана.

Полученную мембрану использовали для изготовления жидкоконтактных электродов: вырезали диски диаметром 7 мм и приклеивали их клеем, содержащим 0,5 М поливинилхлорида в 5 мл циклогексанона, к зачищенному и отполированному поливинилхлоридному корпусу. После высыхания клея внутрь трубки заливали 0,1 М раствор хлорида калия и 1·10^-3 М раствор гентамицина. Изготовленные таким образом электроды кондиционировались в течение суток в 1·10^-3 М растворе гентамицина.

Установлено, что водные растворы гентамицина в зависимости от их концентрации имеют различное значение рН, изменяющееся со временем хранения растворов антибиотика. Электродные функции в свежеприготовленных растворах и в растворах, хранящихся в течение 12 дней, без поддержания рН различаются. Было изучено влияние кислотности среды на потенциал электрода среды и подобрана оптимальная концентрация среды рН 6,0. При этом катионная функция выполняется в интервале концентраций гентамицина 1,8·10^-4-1,8·10^-2 М с угловым коэффициентом 28±2 мВ/рС.

Коэффициенты потенциометрической селективности электродов, чувствительных к гентамицину в присутствии ряда неорганических катионов, других аминогликозидов определяли методом смешанных растворов при постоянной концентрации определяемого иона. Значения коэффициентов потенциометрической селективности K_сел представлены в таблице 1.

Полученные значения коэффициентов селективности позволили сделать прогноз о возможности применения разработанных ионоселективных электродов на основе ионного ассоциата гентамицин-тетрафенилборат для определения гентамицина, канамицина, линкомицина в лекарственных формах и биологических жидкостях при высоких концентрациях ионов натрия, калия, кальция.

Определение гентамицина в лекарственных формах (флаконах и ампулах) с помощью жидкоконтактных электродов проводили методом стандартной добавки. Исходный 10^-1 М раствор гентамицина готовили растворением 1,0625 г его порошка, отвечающего требованиям фармакопейной статьи, в 25 мл дистиллированной воды. Последовательным разбавлением исходного раствора готовили серию стандартных растворов с концентрацией 10^-2-10^-6 М для калибровки индикаторного электрода.

Градуировочный график строили в координатах ЭДС, мВ от отрицательного логарифма концентрации антибиотика.

Результаты определения гентамицина в лекарственных формах приведены в таблице 2.

Где Х- среднее значение из трех параллельных измерений,

ΔX - доверительный интервал,

S_r - относительное стандартное отклонение,

n - число измерений,

Р - доверительная вероятность.

Пример 2.

Определение содержания гентамицина заявляемым способом с использованием разработанных электродов проводили в сыворотке крови человека.

Установлено уменьшение интервала линейности и углового коэффициента электродной функции в сыворотке крови вследствие высокой ионной силы раствора и “белкового отравления” поверхности мембран.

При использовании электродов для определения гентамицина в сыворотке крови индикаторный электрод предварительно кондиционировали в донорской сыворотке крови в течение 20-30 минут. Для получения градуировочных характеристик к 1 мл сыворотки прибавляли из микробюретки последовательно 1,0 мл 10^-2 М раствора гентамицина и измеряли потенциал электрода. С учетом разбавления строили график зависимости ЭДС, мВ от отрицательного логарифма концентрации антибиотика.

Интервал линейности электродной функции составил: 4,9·10^-4-3,6·10^-3 М. Полученные градуировочные характеристики являются воспроизводимыми, и увеличение времени кондиционирования не влияет на них.

Результаты определения гентамицина в сыворотке крови больных по способу стандартных добавок приведены в таблице 3.

С учетом сложности анализируемых объектов и самого определяемого вещества достоверность полученных результатов при реализации способа оценивалась следующим образом. В пробу крови здорового человека вводили определенную добавку стандартного раствора гентамицина и далее пробу проводили через все операции пробоподготовки. Погрешность определения не превышала 0,09.

Таким образом, заявляемый способ расширяет функциональные возможностей экспрессного определения антибиотиков в лекарственных формах и биологических жидкостях за счет расширения спектра исследуемых объектов - аминогликозидных антибиотиков. Способ отличается экспрессностью, возможностью определения активной концентрации антибиотиков в широком концентрационном интервале и дает возможность определения гентамицина в сыворотке крови при инфекционных заболеваниях, например, у больных ангинами и паратонлилитами.

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения концентрации аминогликозитных антибиотиков в исследуемых жидких средах, например, для токсикологического и технического анализа лекарственных средств, в медицине для определения концентрации антибиотика в биосистемах (сыворотке крови и др.) с целью регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний, при исследовании фармакокинетики и др. Техническим результатом изобретения является расширение функциональных возможностей способа за счет расширения спектра исследуемых объектов - аминогликозитных антибиотиков, например, гентамицина в лекарственных формах и биологических жидкостях. Сущность: способ включает измерение ЭДС исследуемой пробы и пробы с добавкой соответствующего антибиотика с помощью индикаторного и сравнительного хлоридсеребряных электродов, в качестве индикаторного электрода используют жидкоконтактный электрод, содержащий ионный ассоциат гентамицин-тетрафенилборат, в качестве пластификатора используют дибутилфталат, который вводят в поливинилхлорид до получения эластичной пленки, при этом концентрация гентамицин-тетрафенилбората составляет 0,4-0,7%. 2 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ количественного определения антибиотиков в лекарственных и биологических средах, заключающийся в приготовлении пробы, помещении ее в электрохимическую ячейку, измерении ЭДС, последующем введении добавки стандартного раствора соответствующего антибиотика, повторном измерении ЭДС и определении количества антибиотика на основе сравнения измеренных параметров ЭДС по расчетной формуле, при этом измерение ЭДС осуществляют сравнительным хлоридсеребряным электродом и индикаторным электродом с пластифицированной поливинилхлоридной мембраной, отличающийся тем, что перед измерениями ЭДС индикаторный электрод предварительно кондиционируют в эталонной среде, а мембрану индикаторного электрода изготавливают на основе ионного ассоциата гентамицинтетрафенилборат, в качестве пластификатора используют дибутилфталат, который вводят в поливинилхлорид до получения эластичной пленки, при этом концентрация гентамицинтетрафенилбората составляет 0,4-0,7%.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробу исследуемой среды, содержащую биологическую жидкость, предварительно центрифугируют до отделения форменных элементов жидкости, а в качестве эталонной среды используют биологическую жидкость без содержания антибиотика, при этом кондиционирование индикаторного электрода осуществляют в течение 20-30 мин.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что пробу исследуемой среды, содержащей лекарственную форму, готовят путем растворения навески препарата в дистиллированной воде, а в качестве эталонной среды используют 10^-3 М раствор антибиотика, при этом индикаторный электрод кондиционируют в течение 20-26 ч.