ПОЛИМЕРНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ АМИНОГЛИКОЗИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРОВ N-(2-ГИДРОКСИПРОПИЛ)МЕТАКРИЛАМИДА В КАЧЕСТВЕ ВЕЩЕСТВ С ПОВЫШЕННОЙ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 1994 года по МПК C08F220/60 A61K31/785 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, точнее к полимерным производным аминогликозидных антибиотиков общей формулы
_ _ ____ ____ _____ __ где А - остаток аминогликозидного антибиотика из ряда, содержащего канамицин, гентамицин;
Х - Гли-, Гли-Лей-, Гли-Фал-Лей-;
l = 75-96 мол. % ; m = 3,5-15,5 мол.%; n = =0,5-17,5 мол.%; мол.м.= (30-46)˙ 10³.

Аминогликозидные антибиотики широко используются в медицинской практике, поскольку они обладают широким спектром антимикробного действия - активны как в отношении грамположительных и грамотрицательный микробов, так и в отношении микобактерий (1,2).

Основными недостатками этих антибиотиков являются:
малое время их циркуляции в организме,
высокая ото- и нефротоксичность, поскольку терапевтические и токсические дозы близки (1).

Известны полимерные производные канамицина на основе целлюлозы или декстрана. Так, на основе декстрана были получены производные с различными типами химической связи между полимером-носителем и антибиотиком (3-5):
а.с ионной связью:
на основе карбоксиметилового эфира декстрана -
D-O-CH₂COO^⊖·H₃N^⊕-A на основе сульфопропилового эфира декстрана-
D-O(CH₂)₃SO⊖3

·H₃N^⊕-A б.с ковалентной связью:
на основе диальдегиддекстрана (альдиминовые производные):
D + NH₂-A _____→ D на основе 3-хлор-2-оксипропилового эфира декстрана получены производные антибиотиков со связью С-N:
D-O-CH₂--CH₂Cl+NH₂-A ____→ D-O-CH₂--CH₂NH-A
Полимер-носитель обеспечивает пролонгацию действия канамицина (4). Однако основным недостатком указанных произв
одных является то, что их антимикробная активность (в расчете на действующее начало) не превышает уровень активности исходного мономерного канамицина, а в некоторых случаях существенно ниже (3,5).

Целью изобретения является повышение антимикробной активности аминогликозидных антибиотиков в расчете на активное начало.

Поставленная цель достигается полимерными производными аминогликозидных антибиотиков на основе сополимеров N-(2-гидроксипропил)метакриламида с N-метакрилоильными производными олигопептидов общей формулы
CH₂^_CH₂^_CH₂^_ где А - остаток аминогликозидного антибиотика из ряда, включающего канамицин, гентамицин;
Х - Гли-, Гли-Лей-, Гли-Фал-Лей-;
l = 75-96 мол; % , m = 3,5-15,5 мол.%, n = 0,5-17,5 мол.%; мол.м. = (30-46) ˙10³.

Способ получения таких производных заключается в следующих технологических операциях
1. Проводят радикальную сополимеризацию N-2-(гидроксипропил)метакриламида с мономером из ряда, содержащего n-нитрофениловый эфир N-метакрилоилглицилглицина, N-метакрилоилглициллейцилглицина, N-метакрилоилглицилфенилаланиллейцилглици-на по схеме
l CH₂=)CH₂=
___→ CH₂^_H l = 75 - 95 мол.%, (m+n) = 4-25 мол.%.

2. Сополимер подвергают взаимодействию с аминогликозидом основанием (схема а) или с сульфатом аминогликозида (схема в) в присутствии тетрабората натрия в водном растворе

3. Полимерные производные II для удаления остаточных n-нитрофенильных групп и несвязанного антибиотика подвергают диализу против 1% раствора NaHCO₃, а затем против воды:
II ___→ CH₂^_CH₂^_CH₂^_ где А - остаток аминогликозидного антибиотика из ряда, включающего канамицин, гентамицин;
Х - Гли-, Гли-Лей-, Гли-Фал-Лей-;
l = 75-96 мол. % , m = 3,5-15,5 мол.%, n = 0,5-17,5 мол.%; мол.м. = (30-46)˙ 10³.

Анализ известного уровня науки и техники подтвердил новизну структуры заявленных полимерных производных аминогликозидных антибиотиков. Анализ показал известность способа получения полимерных производных высокотоксичных цитостатиков (дауномицина, адриамицина) на основе сополимеров N-(2-гидроксипропил)метакриламида (6) общей формулы
CH₂^_CH₂^_CH₂^_
где В - остаток дауномицина, адриамицина;
S - остаток I-аминопропанола-2 или аминогексозы (D-галактозамина, D-глюкозамина, D-маннозамина);
Х - олигопептидный спейсер.

Эти производные были получены радикальной сополимеризацией N-(2-гидроксипропил)метакриламида с n-нитрофениловыми эфирами N-метакрилоилолигопептидов. Полученные сополимеры подвергали взаимодействию с дауномицином или адриамицином. При этом реакция протекает с аминогруппами цитостатиков и n-нитрофенильными сложноэфирными группами сополимеров. Продукт реакции обрабатывают избытком 1-аминопропанола-2 или аминогексозы до полного замещения n-нитрофенильных сложноэфирных групп.

Полученные известные полимерные производные обладают существенно более низким уровнем токсичности.

Аналогичным путем синтезированы полимерные производные ампициллина и аминопенициллановой кислоты (7) и хлорамфеникола (8).

Авторами настоящего изобретения обнаружено новое свойство у полимерных аминогликозидных антибиотиков заявленной структуры - повышенный уровень удельной активности in vivo в расчете на действующее начало. Это подтверждено примерами конкретного выполнения.

Новое свойство полимерных аминогликозидных антибиотиков, обладающих новизной структуры, придает решению соответствие критериям "новизна" и "существенные отличия".

В то же время способ получения новых полимерных производных является способом-аналогом, и в силу этого он неохраноспособен.

Строение полученных производных подтверждено методом УФ-спектроскопии.

П р и м е р 1. Сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида с n-нитрофениловым эфиром N-метакрилоилглицилглицина получали радикальной сополимеризацией. 18 г (0,126 моля) N-(2-гидроксипропил)метакриламида, 4,5 г (0,014 моля) n-нитрофенилового эфира N-метакрилоилглицилглицина (молярное соотношение 90:10) и 1,13 г динитрила азоизомасляной кислоты растворяют в 208 мл ацетона. Раствор продувают аргоном и полимеризуют в атмосфере аргона при 50^оС в течение 30 ч. Образующийся в ходе реакции сополимер выпадает в осадок. Осадок собирают, промывают ацетоном, диэтиловым эфиром и сушат в вакууме до постоянной массы. Выход полимера 13,5 г (60%), (m+n) = 10,2 мол.%, M_w/M_n = 25˙ 10³/20 ˙10³ = 1,25.

Примеры 2 и 3 выполнены в условиях примера 1, все данные приведены в табл. 1.

П р и м е р 4. 10 г сополимера, полученного по примеру 1, растворяют в 40 мл охлажденной до 4 ^оС воды. Добавляют раствор 3 г канамицина основания в 10 мл охлажденной до 4^оС воды. Молярное отношение канамицин : мономерное звено, содержащее n-нитрофениловый эфир, равно 1 : 1. Смесь перемешивают при 4^оС в течение часа, затем подвергают диализу сначала против 1%-ного раствора NaHCО₃, затем против воды. Целевой продукт выделяют лиофильной сушкой. Выход 9,7 г (98% от теории). Количество связанного с полимером канамицина определяют УФ-спектрофотометрически по полосе поглощения λ= 420 нм, характерной для комплекса присоединенного к полимеру канамицина с тринитробензолсульфокислотой (4,9).

Содержание связанного канамицина составляет 8,9 мас.%, т.е. 3,0 мол.%. M_w = 46000, M_w/M_n = 46000/29000 = 1,59.

Примеры 5, 6 выполнены в условиях примера 4, все данные представлены в табл. 2.

П р и м е р 7. 15 г сополимера N-(2-гидроксипропил)метакриламида с n-нитрофениловым эфиром N-метакрилоилглицилглицина, полученного в соответствии с примером 1, растворяют в 90 мл охлажденной до 4^оС воды. Добавляют раствор 7,2 г гентамицин сульфата в 50 мл охлажденной до 4^оС воды. Полученную смесь перемешивают при той же температуре в течение 6 ч, постепенно добавляя 150 мл охлажденного 2,5 мас.% раствора тетрабората натрия.

Реакционную смесь диализуют, лиофилизируют и определяют состав по методике, изложенной в примере 4.

Выход полимерного продукта 14,6 г (97%). Содержание связанного гентамицина 14,0 мас.%, т.е. 5,4 мол.% M_w/M_n = =30000/23000 = 1,30.

Пример 8 выполнен в условиях примера 7, все данные представлены в табл. 2.

Антимикробную активность in vivo целевых полимеров определяют по нижеследующей методике. Белым беспородным мышам (в группе 15 животных) массой 20-22 г внутрибрюшинно вводят 10⁹ микробных тел стафилококка (штамм 209). Через 3 ч после заражения животные получают внутрибрюшинную инъекцию раствора антибиотика или его полимерного производного в физиологическом растворе. Контрольным животным вводят то же количество растворителя.

Через 24 ч брюшинную полость промывают 5 мл стерильного физиологического раствора. Промывной раствор вносят в конические пробирки по 1 мл и центрифугируют 15 мин при 3000 об./мин. Надосадочный раствор отсасывают, осадок дважды промывают и ресуспензируют в 0,1 мл физиологического раствора. Суспензию равномерно распределяют по поверхности чашек Петри. После подсушивания при 37^оС добавляют 7,0 мл расплавленного мясо-пептонного агара. Чашки выдерживают 48 ч при 37^оС и подсчитывают количество выросших колоний.

Для оценки активности препарата расчитывают индекс подавления (ИП).

ИП = 100% , где Н_к - количество микроорганизмов в промывных водах контрольных животных,
Н_о - количество микроорганизмов в промывных водах опытных животных.

Данные по антимикробной активности антибиотиков и их полимерных производных представлены в табл. 3. Анализ данных табл. 3 подтверждает, прежде всего, что достигнута заявленная цель изобретения - активность заявленных полимерных производных аминогликозидных антибиотиков значительно выше, чем у исходных миномерных соединений.

Так, для канамицина концентрация 10 мкг/мышь характеризуется индексом подавления, равным 0. Для полимерных производных при той же дозе индекс подавления равен 42-56, что превышает показатель того же индекса для дозы мономерного канамицина 1000 мкг/мышь (ИП = 33).

Аналогично ИП гентамицина при дозе 100 мкг/мышь равен 16, для полимерных производных ИП равен 32 - 34.

Анализ данных табл. 1 и 2 подтверждает существенность заявленных признаков изобретения, т.е. интервала заявленной пептидной последовательности (Х), l, m, n и мол.м.

Использование: в медицине, ветеринарии. Сущность изобретения: полимерные производные аминогликозидов на основе сополимеров N-(2-гидроксипропил)метакриламида общей формулы где А - остаток аминогликозидного антибиотика из ряда, содержащего канамицин, гентамицин; Х - Гли -, Гли-Лей-, Гли-Фал-Лей-; l = 75 - 96 мол.%, m = 3,5 - 15,5 мол.%, n = 0,5 - 17,5 мол.%; мол.м. = (30-40)·10³ , в качестве веществ с повышенной антимикробной активностью. 3 табл.

Полимерные производные аминогликозидных антибиотиков на основе сополимеров N-(2-гидроксипропил)метакриламида общей формулы
___ _ ___ _
где A - остаток аминогликозидного антибиотика из ряда, содержащего канамицин, гентамицин;
X - Гли-, Гли-Лей-, Гли-Фал-Лей-;
l = 75 - 96 мол.%;
m = 3,5 - 15,5 мол.%;
n = 0,5 - 17,5 мол.%;
мол.м = (30 - 40) · 10³,
в качестве вещества с повышенной антимикробной активностью.