Штамм дрожжей ТRIсноSроRоN сUтаNеUм - источник белковой биомассы "Биогил" и способ ее получения Советский патент 1988 года по МПК C12N1/16 C12N1/16 C12R1/645 

. 14

Изобретение относится к микробиологической промьшленности и касается нового штамма дрожжей - источника белковой биомассы и способа ее получения с использованием в качестве источника углерода гидролизного лигнина.

Целью изобретения является штамм дрожжей Trichosporon cutaneum, поз- воляющий получить в процессе культивирования более высокий &ькод биомассы с повышенньм содержанием в ней .белка.

Изобретение в части штамма Tricho sporon cutaneum заключается в следующем .

Штамм Т. cutaneum был получен на штамме Т. cutaneum 70 следующим образом.

Водную суспензию культуры Т.cutaneum 70 рассевали в чашки Петри с агаризованной средой Чапека-Докса, содержащей в качестве источника углерода тонкоизмельченный гидролиз- ный лигнин. Добивались получения отдельных колоний. Через 4 сут выращивания наиболее крупные колонии использовали для засева жидкой питательной среды с гидролизным лигнином Глубинное культивирование проводили в колбах на качалке в течение 3 сут, получаемой лигнобиомассе опредбшяли держание белка и лигнина Класона. За

тем из глубинной культуры делали пассаж на чашки Петри с агаризованной средой и отбирали однородные колонии, которые снова выращивали в глубинных условиях. После 3-кратного пассажа получили штамм, накапливающий до 22% сырого протеина и разлагающий до. 25% лигнина Класона. Штамм хранят на сусло-агаре при 10-15°С. Пересев производят один раз в 3 мес.

При хранении и пассеровании на суслоагаре уровень биосинтетической активности штамма не снижается.

Штамм. Т. cutaneum Д-46 депонирован во Всесоюзной коллекции промьшшеиных микроорганизмов под номером БКПМ У-495 и имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

В односуточной культуре на солодовом сусле клетки овальные, удлиненно-овальные, собраны в цепочки и одиночные (иногда неправильной формы) , размером 2,4-6,4-4,2-2,1 мкм.

Q

5

0

5 0 -

5

0

В 10-суточной культуре на сусло- агаре образует хорошо развитый мицелий, распадающийся на артроспоры, встречается псевдомицелкй. На гифах часто встречаются дополнительные выросты.

Сусло - агар. Штрих обильный, сухой, матовый, возвьопающийся, морщинистый, покрыт светлым пушком. Для 7- суточной культуры характерны колонии сероватого цвета, белая замшевость остается только в центре, заметно начало ослизнения колоний. Поверхность крупноскладчатая, основание полупрозрачное.

Солодовьй сусло-агар. Штрих обиль- ньй, серовато-кремовый с крупноскладчатой поверхностью, профиль выпуклый, край фестончатьм, консистенция плотная. Для 7-суточной культуры характерны колонии серовато-кремовые, ок- .руглой-формы, вьшуклые, с возвьшаю- щимся складчатым центром. Край фес- стончатый. Основание колонии менее опушено, почти прозрачное.

Агар Чапека-Докса с гидролизным лигнином. Штрих беловатого цвета, складчатый, слабовыпуклый, поверхность матовая, бархатистая. Для 7- суточной культуры характерны беловатого цвета колонии округлой формы, матовые, слабовыпуклые, край фестончатый. На верхушке колоний ободок с углублением.

Физиолого-биохимические признаки.

Отношение к углеводам. Сахлра не. сбраживает. Ассимилирует глюкозу, галактозу, сахарозу, фруктозу, лактозу, рафинозу, ксилозу, Д-арабино- зу, рамнозу, слабее - сорбозу, трега- лозу, мелибиозу, мелицитозу. Расщепляет крахмал, целлюлозу.

Отношение к

церин, дульцит,

спиртам.

Усваивает маннит, сорбит.

0

5

этанол.

Отношение к кислотам. Усваивает молочную, янтарную, лимонную, уксусную, муравьиную, фумаровую, яблочную, щавелевую кислоты.

Отношение к источникам азота. Использует аммонийный азот, нитратный, азот аспарагина, пептона, мочевины. Не усваивает нитриты и азотнокислый калий.

Стимулирующие рост витамины - тр- амин и биотин. Культура хорошо растет на гидролизном лигнине, являясь деструктором данного субстрата.

Отношение к температуре. Оптимум роста при 30-35°С, выдерживает температуру до 40 С.

Отношение к кислороду. Аэроб.

Растет в широких пределах рН 3,5-8,3 с оптимумом 4,5-5,5.

Токсикологические исследования, проведенные в Белорусском научно-ис- следовательном институте ветеринарии показали безвредность как самого шта ма, так и продукта, полученного путем глубинного выращивания культуры на гидролизном лигнине.

Способ получения белковой биомассы заключается в следующем.

В состав питательной среды, содержащей 7,5-12,5 г/л (по сухой массе) гидролизного лигнина, 1-2 г/л аммония фосфорнокислого двузамещенного, качестве водной основы добавляют до 1 л декантат последрожжевой бражки, являющейся отходом гидролизно-дрож- жевого производства (табл. 1)

Из данных табл. 1 видно, что бо- лее высокие или низкие концентрации компонентов приводят либо к резкому уменьшению выхода лигнобиомассы, либо к ухудшению ее качественного состава за счет снижения содержания сырого протеина и увеличения лигнина Класона, что одинаково экономически не выгодно.

Последрожжевая бражка является основным компонентом сточных вод Боб руйского гидролизного завода и имеет следующий состав: редуцирующие вещества 0,09-0,2%, органические кислоты 0,12-0,2% (в пересчете на ук

сусную), летучие кислоты 0,015-0,03% азот 90-120 мг/л, Р 0550-70 мг/л.

Необходимость декантации бражки перед добавлением в питательные среды обусловлена наличием в ней остаточного количества дрожжевой биомассы, искажающей истинный процесс деструкции гидролизного лигнина штаммом Т. cutaneum ВКПМ У-495. Декантат бражки содержит все ее основные растворимые кo moнeнты и является дополнительным источником легкоусвояемого углерода, азота, фосфора в среде.

Полученный после выращивания щтам ма ВКПМ У-495 на предлагаемой среде белковый продукт Биогил имеет химический состав, приведенный в табл.

По сравнению с исходным субстра- том Биогил обогащен фосфором, содежит в 10-13 раз больше белка и значи

10

ts

20

30402

тельно меньше трудногидролизуемьгх компонентов - лигнина Класона и целлюлозы. В связи в этим перевариваемость J. лигнобиомассы почти в 4 раза вьппе пере- вариваемости гидролизного лигнина и достигает 40%. По содержанию нуклеиновых кислот (до 1,2%) Биогил приближается к обычным продуктам питания (мясу, печени), и его использование в кормовых рационах не создает опасности нарушения пуринового обмена у животных. Кормовая ценность лигнобиомассы повьш1ается, благодаря наличию в ней легкоусвояемого жира, в составе которого преобладают ненасьш1ен- ные жирные кислоты, в том числе незаменимые - линолевая, линоленовая и арахидоновая, обладающая F-витамин- ной активностью.

Жирнокислотный состлв лип1-иов продукта БИОГИЛ следующи11, % от общего количества:

40

77,60

3,6:1 Для сравнения

Ненасыщенных

кислот

Ненасыщенных/

/насыщенным 5 Пример 1

лигнолитической (определяемой по снижению лигнина Класона в лигнобиомас- .- сах) и белоксинтезирующей актив- ; ности предлагаемого и известного 0 штаммов культивирование Т.cutaneum ВКПМ У-495 проводят в колбах Эрлен- мейера емкостью 300 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке (200 об/мин)

в течение 48 ч при 30 С на известной питательной среде следующего состава, г/л: измельченный гидролизный лигнин 10 (по сухой массе); , 1 , MgS040,5, кукурузный зкст- ракт 4; вода водопроводная до 1-л.

5. 1

Гидролизный лигнин получен.,на Бобруйском гидролизном заводе и имеет следующий состав,%: экстрактивные вещества 1 водорастворимые 3J легко- трудногидролизуемые лигни-н Класо на 57; минеральные вещества 6.

Питательную среду в колбах подвергают 15-минутному кипячению, охлаждают и засевают 2-суточной культурой T.cutaneum ВКГТМ У-495, выращенной на пивном сусле (4 по Баллингу) в колбах на качалке (200 об/мин) при 30 С Количество посевного материала 10об.

Сравнение основных показателей гл бинного культивирования предлагаемог И известного штаммов - декструкторов Гидролизного лигнина приведено в тпбл. 3.

Полученнь е результаты ( лбл. 4) свидетельствуют о том, чт1.. ч сравнении с известным штаммом - декструкто ром гидролизного лигнина, предлагаемый продуцент отличается более высо- ой продуктивностью синтеза биомассы протеина и при меньшей продолжи- ельности культивирования обеспечивает более полную деструкцию лигни- На Класона.

Пример 2. В целях оптимизации и удешевления питательной среды для выращивания штамма Т. cutaneum ВКГГМ У-495 в ее состав в качестве основного источника углерода вводят измельченный гидролизный лигнин 10 г/л (NH)J ИРО, 1 ,5 г/л и декантат после- дрожжевой бражки до 1 л, рН среды 4,5-5,5. Условия культивирования,как 1 примере 1 , Выход лигнобиомассы 14 г/л., содержание в ней сырого протеина 21 %, лигнина Класона 40%.

Пример 3. Культивирование проводят в полустерильных условиях в ферментере (полезный объем 10 л) при 30°С, скорости перемешивания 300 об/мин и интенсивности азрации 1 л/л«мин.

Способ приготовления посевного материала, как в примере 1. Питатель- ная среда, как в примере 2.

В целях повышения технологичности процесса приготовление питательной среды включает тщательное перемешивание всех компонентов, доведение рН и последующую фильтрацию суспензии через сито с диаметром отверстий 1 мм что позволяет исключить стадию пред- Б:арительного высушивания и измельче

0

0

5

5

0

5

0

5

0

5

ния гидролизного лигнина. Количество вносимого гидролизного лигнина корректируют с учетом исходной влажности и потерь за счет отделения грубой фракции при фильтрации. Затем среду подвергают 15-минутному кипячению, охлаждают и засевают 2-суточной культурой T.cutaneiom ВКГТМ У-495. Количество посевного материала 25 об.% обеспечивает доминирующее развитие предлагаемого штамма над посторонней микрофлорой в начальный период полустерильной ферментации.

В табл. 4 представлена динамика роста и потребления питательных веществ штаммом Т. cutahexm В1СПМ У-495 на среде с гидролизным лигнином и бражкой.

За 24-32 ч культивирования выход лигнобиомассы составляет. 13- 4,3 г/л, содержание сырого протеина 2f-23%, содержание лигнина Класона около 40%, Общее снижение концентрации лигнина Класона в культуральной жидкости за 72 ч ферментационного процесса составляет по сравнению с исходной средой 26,3%.

Формула изобретений

1.Штамм дрожжей Trichosporon cutaneum ВКПМ У-495 - источник белковой биомассы.

2.Способ получения белковой биомассы, предусматривающий приготовление жидкой питательной среды, содержащей в качестве источника углерода гидролизный лигнин источники азота и фосфора, водную-основу, и выращивание микроорганизма-продуцента в оптимальных условиях до максимального накопления белковой биомассы, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы, в качестве водной основы используют декантат последрожжевой бражки, являющийся отходом гидролизно-дрожжевого производства, при этом компоненты питательной среды используют в следующем соотношении, г/л:

Гидролизный лигнин 7,5-12,5 Аммоний фосфорнокислый двузамещенный I- 2 Декантат последрожжевой бражкиДо 1 л,

а в качестве штамма дрожжей используют Trichosporon cutaneuni ВКПМ У-495.

Таблица I

Изобретение относится к микробиологической промьшшенности и касается нового штамма дрожжей - источника белковой биомассы и способа ее получения с использованием в качестве источника углерода гидролизного лигнина. Целью изобретения является штамм дрожжей Trichosporon cutaneijra ВКПМ У-495, позволяющий получить в процессе культивирования более высокий выход биомассы с повышенным содержанием в ней белка. Изобретение заключается в том, что штамм T.cuta- neiim ВКГГМ У-495 выращивают на питательной среде, содержащей 7,5-12,5 г/л гидролизного лигнина, 1-2 г/л аммо- ния фосфорнокислого двузамещенного, а в качестве водной основы добавляют до 1 л декантат. последрожжевой бражки, являющийся отходом гидролиз- но-дрожжевого производства. После 48 ч культивирования штамма ВКПМ У-495 на предлагаемой питательной среде выход лигнобиомассы составляет 13 г/л. Содержание в ней сырого протеина 19-21 г/л, лигнина Класона 37-40%. 2 с.п. ф-лы, 4 табл. S сл 4 со

Оптимизация питательной среды для глубинного культивирования штамма Trichosporon cutaneum ВКПМ У-495

Примечание:В качестве жидкой фазы во всех вариантах,

за исключением последнего, использован декантат последрожжевой бражки.

Гидролизный

лигнин2,0-2,6 0,8-1,2

Виогил 21, 10,2-12,5

Исходная питаТаблица 2

4,5-5,0 Следы 57-5926,6-28,0

)

5,5-6,0 1,5-2,0 36,4-39,7 12,6-14,1

.Таблица 3

Продолжение табл.4