ШТАММ ДРОЖЖЕЙ HANSENULA SPECIES - ПРОДУЦЕНТ КОРМОВОЙ БИОМАССЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N1/16 C12N1/16 C12R1/78 

Предлагаемое изобретение относится к области микробиологической, гидролизно-дрожжевой и пищевой промышленности и представляет новый промышленный непатогенный штамм дрожжей Hansenula Species ВСБ-943 продуцент кормовой биомассы, характеризующийся высокой продуктивностью при культивировании на мелассе и гидролизате древесины.

Интенсификация процесса производства кормовых дрожжей и повышение качества готового продукта в значительной степени определяется свойствами промышленного штамма продуцента.

Известны штаммы дрожжей, используемые в качестве культур-продуцентов для производства кормовой биомассы на сахаросодержащем субстрате, в частности мелассе (авт. свид. СССР N 1620478 С 12 N N 1/16, C 12 R 1/72; N 1622389; N 1643606; N 1677057; N 1595900; N 1571061; N 1532580; N 1463755; N 1411335; N 1419149 ДСП; N 1427820 ДСП; N 1507788 ДСП; патент ГДР N 124658 C 12 N 1/16; патент ГДР N 275070). Недостаток этих штаммов заключается в том, что по систематическому положению они относятся к несовершенным дрожжеподобным условно патогенным микроорганизмам рода Candida. Это снижает их потребительскую способность. Кроме того, использование дрожжей рода Candida в качестве культуры продуцента требует усложнения технологии производства путем обязательного введения стадии термообработки получаемой кормовой биомассы для гарантированного обеспечения отсутствия живых клеток в готовом продукте.

Известны штаммы несовершенного дрожжеподобного гриба рода Trichosporon, который также используют в качестве культур продуцентов для получения кормовой биомассы (авт. свид. СССР N 1482941; N 803472 ДСП; N 632201 ДСП; N 606518 ДСП; патент ГДР N 2788354). Недостатками этих штаммов являются низкая скорость роста, нетехнологичность (плохая сепарируемость), а также морфологическая нестабильность культур, заключающаяся в диморфизме клеток, что снижает продуктивность культуры и качество готового продукта.

Более перспективными, с биологической точки зрения, являются штаммы дрожжей, по систематическому положению относящиеся к совершенным грибам. Так, например, известны штаммы сахаромицетов, применяемых для производства кормовой биомассы (патент Франции N 2646435; патент Франции N 2646436; авт. свид. СССР N 1677057; N 1742320; N 1575570 ДСП; патент США N 4379845). Недостатком этих штаммов является отсутствие способности к активному росту в условиях непрерывного процесса культивирования.

Наиболее близким аналогом предлагаемого штамма является штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ У-760 источник белка и биологически активных веществ. (Авт. свид. СССР N 1575570 С 12 N 1/16). Штамм S. cerevisiae ВКПМ У-760 выращивают в непрерывном процессе в режиме рН-стата на среде с сахарозой, либо мелассе, либо гидролизате при концентрации 8 г/л (в расчете на сахар), при этом получают концентрацию биомассы в среде 3,92 3,95 г АСВ/л, продуктивность 2,07 2,58 г АСВ/л • час (определение весовым методом). Недостатком штамма S. cerevisiae ВКПМ У-760 является способность роста при низкой концентрации субстрата в среде, что нетехнологично и снижает экономическую эффективность процесса культивирования. Другой недостаток штамма заключается в низкой продуктивности и высоком расходном коэффициенте (около 2), что снижает производственные показатели штамма. К числу недостатков штамма, исходя из его систематического положения, можно отнести способность к сбраживанию различных сахаров (глюкоза, галактоза, сахароза, мальтоза и раффиноза), что может приводить к вздутию животов при скармливании животным.

В связи с изложенным задача предлагаемого изобретения заключалась в селекции активного непатогенного штамма дрожжей, по систематическому положению относящегося к высшим грибам и характеризующегося производственноценными свойствами: высокой продуктивностью, технологичностью и благоприятными биологическими свойствами (отсутствием способности к брожению) при росте на мелассе и гидролизатах древесины.

Предлагаемый новый штамм дрожжей получен в процессе промышленной селекции из числа изолятов, выделенных из биоценоза промышленных ферментеров Волжского гидролизного завода. Для этого дрожжевую суспензию, отобранную из ферментеров, рассевали в чашки Петри с сусло-агаром и отбирали изолированные колонии (изоляты), которые далее проверяли на активность роста в колбах на качалке, используя в качестве питательного субстрата гидролизат древесины без фурфурола с содержанием редуцирующих веществ 1,5% Было исследовало более 100 изолятов, активность роста которых составляла 1,5 7,5 г/л. Из их числа было отобрано 8 наиболее активных изолятов с активностью роста 6,0 7,5 г/л. Отобранные 8 изолятов дрожжей были испытаны в условиях проточного культивирования в аппарате интенсивного массообмена на синтетической среде Ридер с 2% глюкозы и на гидролизате древесины с содержанием редуцирующих веществ 1,8 2,0% что позволило получить искомый штамм, обозначенный в музейной коллекции института под номером ВСБ-943.

Определение систематического положения отобранного штамма ВСБ-943, проведенное в соответствии с определителем дрожжей Крегер-ван-Рай (The Yeast. A taxonomyc etudy. Ed. by Kreger-van-Rij. N.I.W. Amsterdam 1984), показало его принадлежность к Hansenula species.

Определение степени патогенности селекционированного штамма Hansenula species ВСБ-943 подтвердило отсутствие патогенности.

Характеристика штамма дрожжей Hansenula sp. ВСБ-943.

Морфологические признаки: клетки на солодовом сусле трехсуточной культуры овальные, короткоовальные, округлые, одиночные и небольшими веточками и цепочками. Аскоспоры шляповидной формы.

Культуральные признаки: колонии на солодовом сусло-агаре грязно-белого цвета, выпуклые с ровным и слабоволнистым краем, гладкие, слабо блестящие. Штрих на солодовом сусло-агаре (30-суточная культура) гладкий с ровным или слабоволнистым краем, матовый, серовато-бежевого цвета. На жидком солодовом сусле кольца и пленки не образует; осадок плотный, светлый.

Физиолого-биохимические признаки: ассимилирует глюкозу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, мелецитозу, ксилозу, рибозу, рамнозу, глицерин, дульцит, рибит, маннит, сорбит, α метил-Д-глюкозид, салицин, эритрит, молочную и лимонную (слабо) кислоты. Не ассимилирует галактозу, сорбозу, лактозу, мелибиозу, раффинозу, растворимый крахмал, L- и Д-арабинозу, инозит, янтарную кислоту. Сахара не сбраживает. Не нуждается в витаминах и других дополнительных факторах роста.

Штамм Hansenula species ВСБ-943 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции микроорганизмов под номером У-2133.

Штамм Hansenula species ВСБ-943 был испытан в камеральных условиях в ферментере объемом 40 л (рабочий объем 20 л) на минеральной среде Ридер, в которой источником углерода служила меласса Уфимского завода по производству пекарских дрожжей при высокой концентрации субстрата 3,75 и 5,0% рН среды составил 5,0 5,9, температура роста 34 и 37^oC.

Засевную биомассу готовили путем выращивания одно-двухсуточной культуры дрожжей в качалочных колбах с минеральной средой Ридер, в которой источником углерода служила 2% глюкоза или сахароза либо 5% меласса (температура роста 32 34^o, рН среды 5,5).

Для сравнительной оценки исследования также были проведены со следующими штаммами дрожжей: Saccharomyces cerevisiae (прототип), Candida utilis ВСБ-726, C. valida ВСБ-825 и С. tropicalis ВСБ-936. Последние три штамма используются в качестве культур-продуцентов на Башкирском БХК при производстве паприна и эприна.

Согласно полученным данным (таблица 1) при периодическом культивировании штамм Hansenula sp. ВСБ-943 имел выход биомассы (абсолютно сухой биомассы) от мелассы 72 73% расходный коэффициент 1,36 1,4, содержание сырого протеина 54 56,0. Штамм-прототип S. cerevisiae в этих же условиях имел следующие показатели: выход АСМ 49,0% расходный коэффициент 2,04, содержание сырого протеина 45,4%
Для других исследованных штаммов выход биомассы составил 57,6 66,8% расходный коэффициент 1,4 1,8, содержание сырого протеина 50,5 52,7%
Штамм дрожжей Hansenula sp. ВСБ-943, показавший лучшие результаты в камеральных условиях был испытан в промышленном ферментере отделения чистой культуры Башкирского биохимкомбината. При этом на стадии накопления в периодической культуре был достигнут выход 96,0% расходный коэффициент 1,04. В непрерывном режиме процесса культивирования продуктивность штамма Hansenula sp. ВСБ-943 составила 6,2 и 7,1 г/л/час (таблица 2).

Дополнительные исследования штамма были выполнены по изучению активности роста на гидролизных средах.

Известно, что гидролизные среды характеризуются сложным химическим составом, включающим, помимо углеводов (глюкозы, маннозы, галактозы, фруктозы, ксилозы и арабинозы), различные летучие нейтральные вещества и различные летучие и нелетучие органические кислоты, совокупность которых определяет качество питательной гидролизной среды и продуктивность культуры-продуцента. Из числа летучих нейтральных веществ в гидролизате имеются такие вещества, как фурфурол, метилфурфуpов, оксиметилфурфурол, формальдегид, обладающие сильным ингибирующим действием. Штамм Hansenula sp. ВСБ-943 был испытан в модельных острых опытах по влиянию фурфурола на активность накопления биомассы. Для этого культуру выращивали в колбах на качалке при температуре 30 34^oC на минеральной среде Ридер с автолизатом 0,5% объемн. и 2% глюкозы при содержании фурфурола в количестве 0,02 0,5% (объемн.). Контролем служил рост дрожжей на той же среде без фурфурола. Засевным материалом служила дрожжевая суспензия односуточной культуры на сусло-агаре при исходной оптической плотности 0,5 отн. ед. Продолжительность процесса выращивания составляла 24 часа. В результате проведенных исследований показана возможность роста штамма Hansenula sp. ВСБ-943 на питательной среде с 0,02 0,04% объемн. фурфурола: накопление биомассы на среде с 0,02% объемн. фурфурола составило 6,9 7,2 отн. ед. опт. пл. при концентрации фурфурола 0,04% объемн. 3,6 4,0, в контроле 7,9 8,2.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.

Пример 1
Штамм дрожжей Hansenula species ВСБ-943 культивировали в периодической культуре в лабораторном ферментере объемом 40 л (рабочий объем 20 л) на минеральной среде следующего состава (г/л): (NH₂)₂SO₄ - 3, MgSO₄ 0,7, NaCl 0,5, Ca(NO₃)₂ 0,4, KH₂PO₄ 1,0, K₂HPO₄ 0,1. рН среды 5,0 5,9, температура роста 37^oC. Субстратом служила меласса Уфимского завода пекарских дрожжей со следующей характеристикой: удельная плотность 1,34, рН 6,4, содержание сухих веществ 82% содержание сахарозы 51 52% SO₃ - 0,06% азота 1,6 1,7, K₂O 3 5% Микробное число мелассы составляло 10⁴ кл/мл. Доброкачественность мелассы 62% Концентрация мелассы в среде 3,75% Засевную биомассы готовили путем выращивания односуточной культуры в качалочных колбах с вышеприведенной минеральной средой и 2% глюкозы при температуре роста 37^oC и рН среды 5,5.

Получены следующие показатели: максимальное накопление биомассы (АСМ) 29,0 г/л, выход биомассы (АСМ) от мелассы 73,3% выход биомассы (АСМ) от сахарозы 143,9% расходный коэффициент 1,36, время накопления 9 час, содержание сырого протеина в биомассе 54,3% доминирование штамма в биоценозе 80%
Штамм S.cerevisiae Сар.-12 (прототип) в тех же условиях при оптимальной температуре роста 30^oC и содержании мелассы в среде 5% имел следующие показатели: максимальное накопление биомассы 24,5 г/л, выход от мелассы 49,0% выход от сахарозы 95,0% расходный коэффициент 2,04, время выращивания 8 час, содержание сырого протеина 45,4% доминирование штамма в биоценозе 70%
Пример 2
Штамм Hansenula species ВСБ-943 выращивали по примеру 1, но при температуре роста 34^oC и концентрации мелассы в среде 5,0%
Получены следующие показатели: максимальное накопление биомассы 36,2 г/л, выход АСМ от мелассы 72,3% выход АСМ от сахарозы 141,8% расходный коэффициент 1,4, время выращивания 9,5% содержание сырого протеина 56,0% доминирование штамма в биоценозе 90%
Показатели штамма S. cerevisiae Сар.-12 (прототип) приведены в примере 1.

Пример 3
Штамм Hansenula sp. ВСБ-943 выращивали в периодической культуре в промышленном ферментере V 200 л (рабочий объем 100 л) отделения чистой культуры Башкирского БХК. Минеральное питание представляло раствор аммофоса и калия, содержащий азота 11,0 12,5 г/л, фосфора 41,2 46,9 г/л P₂O₅, калия 11 20 г/л, а также раствора микроэлементов с содержанием железа 4,0 г/л, цинка 0,9 1,1 г/л, марганца 0,1 0,13 г/л, магния 3,0 3,3 г/л. Поддержание рН на уровне 7,0 обеспечивали аммиачной водой с содержанием 24,5 26,1% аммиака. Температура роста 35 37^oC.

Получены следующие показатели: максимальное накопление биомассы (АСМ) 48 г/л, выход АСМ от мелассы 96,0% выход АСМ от сахарозы 149,0% расходный коэффициент 1,04.

Штамм S. cerevisiae Сар.-12 (прототип) в этих же условиях культивирования не растет происходит защелачивание питательной среды.

Пример 4
Штамм дрожжей Hansenula species ВСБ-943 выращивали по примеру 3, но в условиях непрерывного процесса культивирования (18 часов) при коэффициенте разбавления среды Д 0,2 час^-1 (скорость протока 20 л/час). рН среды 5,8 7,0, температура роста 35 37^oC.

Получены следующие показатели: концентрация биомассы (АСМ) составила 31,2 г/л, выход АСМ от мелассы 62,4% выход АСМ от сахарозы 122,4% расходный коэффициент 1,6, продуктивность 6,24 г/л/час.

Характеристика роста штамма S. cerevisiae Сар.-12 (прототип) та же, что в примере 3.

Пример 5
Штамм дрожжей Hansenula sp. ВСБ-943 выращивали по примеру 3, но в условиях непрерывного процесса культивирования (46 час) при коэффициенте разбавления Д 0,25 час^-1 (скорость протока 25 л/час). рН среды 5,0 - 6,9, температура роста 32 35^oC.

Получены следующие показатели: концентрация биомассы (АСМ) 28,4 г/л, выход АСМ от мелассы 56,8% выход АСМ от сахарозы 111,3% расходный коэффициент 1,7, продуктивность 7,1 г/л/час.

Характеристика роста штамма S. cerevisiae Сар.-12 (прототип) та же, что в примере 3.

Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что предлагаемый штамм Hansenula species ВСБ-943 является новым углеводассимилирующим штаммом, характеризующимся следующими отличительными признаками от прототипа S. cerevisiae Сар.-12:
активно растет на питательной среде с мелассой, обеспечивая выход абсолютно сухой биомассы от заданного субстрата 72 96%
активно растет на гидролизате древесины с содержанием фурфурола 0,02 - 0,04%
активно растет в широком диапазоне рН среды 5,0 7,0 и температуры роста 30 37^oC;
активно растет в условиях непрерывного процесса культивирования, обеспечивая продуктивность при оптимальной скорости роста (Д 0,2 0,25 час_-1) на уровне 6,2 7,1 г/л/час;
не способен сбраживать сахара, что важно при скармливании животных кормовыми дрожжами (не вызывает вздутие животов) с одной стороны и, с другой, упрощает технологию производства кормовых дрожжей с использованием предлагаемого штамма, так как не требует гарантированного отсутствия живых клеток продуцента в готовом продукте;
конкурентоспособен, обеспечивая высокое доминирование в биоценозе ферментеров в условиях нестерильного процесса культивирования;
стабилен по своим морфолого-культуральным и физиологическим свойствам, что важно для промышленности, характеризующейся возможными колебаниями состава питательной среды и физико-химических параметров роста.

На основании данных проведенных исследований штамм дрожжей Hansenula species ВСБ-943 рекомендован к промышленному внедрению в качестве культуры-продуцента на Башкирском биохимкомбинате для производства кормовых дрожжей на мелассе.

Использование: микробиологическая, гидролизно-дрожжевая и биотехнологическая промышленность и представляет новый промышленный непатогенный штамм дрожжей Havsenula Species У-2133 - продуцент кормовой биомассы, характеризующийся высокой продуктивностью при культивировании на мелассе и гидролизате древесины. Сущность изобретения. Новый штамм дрожжей получен в процессе промышленной селекции из числа изолятов, выделенных из биоценоза промышленных ферментеров. Депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под N У-2133. Штамм Hansenula Species У-2133 испытан в камеральных условиях в ферментере объемом 40 л (рабочий объем 20 л) на минеральной среде Ридер, в которой источником углерода служила меласса в концентрации 3,75 и 5,0 %, рН среды 4,5 - 7,0, температура роста 30 - 37^oC. При периодическом культивировании штамм Hansenula Species У-2133 имел выход абсолютно сухой биомассы 72 - 73% от заданной мелассы, расходный коэффициент 1,36 - 1,4, содержание сырого протеина в биомассе 54 - 56%. Штамм Hansenula Species У-2133 испытан в промышленных условиях. При этом на стадии накопления в периодической культуре был достигнут выход 96,0%, расходный коэффициент 1,04. В непрерывном процессе культивирования продуктивность штамма Hansenula Species У-2133 составила 6,2 г/л/час (коэффициент разбавления среды Д = 0,2 час^-1) и 7,1 г/л/час (коэффициент разбавления среды Д = 0,25 час^-1). Штамм Hansenula Sp. У-2133 испытан в модельных опытах на среде Ридер с глюкозой (2%) и фурфуролом (0,02 - 0,5 % объемн.) и была показана возможность роста штамма на питательной среде с 0,02 - 0,04 % объемн. фурфурола. 2 табл.

1 Штамм дрожжей Hansenula species ВКПМ У-2133 продуцент кормовой биомассы.