Способ определения гексозаминов в медицинских препаратах Советский патент 1988 года по МПК G01N21/17 G01N21/78 

4ib

оа со

4ii 1 О)

Изобретение относится к биохимии и фармакологии, а именно к определе- FiHio содержания гексозаминов в меди- дииских препаратах, содержащих гли- козаминогликаны в качестве основного фармакологически активного компо.нен- та, и можеть быть использовано при контроле качества препаратов и для установления влияния отдельных тех- нологических операций па вькод этих биологически активных компонентов в препаратах. Кроме того, этот способ может быть использован при проведении диагностики заболеваний, связан- HLK с нарушением обмена этих соединений.

Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа за счет сокращения числа трудоемких операций

Способ осуществляется следующим образом.

После отбора пробы препарата проводят ее гидролиз соляной кислотой при 115-120 С, полученный гидролизат нейтрализуют раствором едкого натра до рИ 6,0-8,0 и проводят отбор нейтрализованного гидролизата, в который вводят 1,,5%-ньй раствор ацетила- цгтопа в бикарбонате натрия и далее смесь нагревают до температуры 97+1 С и охлаждают до TeNmepaTypH 20 + 1°С, затем осуществляют цветную реакцию

Отбор пробы

препарата- ---

путем введения этилового спирта в объемном соотношении к гидролизату 1:10 и смеси парадиметиламинобензаль- дегида, концентрированной соляной кислоты и этилового-спирта, которые берут в соотношении 0,08:1:1,5 (реактива Эрлиха). Количественное содержание гексозамина в медицинских препаратах определяют по следующей формуле:

V, V,

100 %,

де С - количество гексозамина в

1 мл, найденное по калибровочному графику, мг;

а - навеска препарата, мг;

.V - объем нейтрализованного

гидролизата, мл;

V - объем разбавленного гидро- лизата перед нейтрализацией, мл;

V - объем гидролизата, взятый для нейтрализации, мл;

V - объем нейтрализованного гидролизата, взятьш для реакции, мл;

too - множитель дли перевода, %.

- Предлагаемый способ определения содержа}шя гликозаминогликанов в ме- дигщнских препаратах может быть схе--- матично представлен в следующем виде:

Гндр олиэ.сОЛЯ ной киел от он

основного действующего ве- ;«щества до гексоэамина 115- 20° С

Изобретение относится к биохимии и фармакологии. Цель изобретения -по- вЫшение точности и упрощение способа. После отбора пробы препарата проводят ее гидролиз соляной кислотой при 115- 120°С. Гидролизат нейтрализуют раствором едкого натрия до рН 6,0-8,0. Проводят отбор нейтрализованного гид- ролизата, в который вводят раствор ацетилацетона в бикарбонате натрия. Смесь после нагревания охлаждают. К гидролизату добавляют этиловый спирт, парадиметиламинобензальдегид, концентрированную соляную кислоту и этанол. Затем определяют количественное содержание гексозаминов. Способ применим для определения кератансуль- фата из роговицы глаза и гликозами- ногликанов, выделенньгх из 12-перст- ньЕХ кишок свиней. S

1 ейтрапнзац ш гидролизата раствором едкого атра до слаСпуцепочиой реакции

Оклаядение

до 20 i I C

Нагревание 07 i

Добавлегше

реактива

Эрлиха

. Отечественная промышленность для медицинских целей вьшускает следую- wf ..e препараты, содержащие гликозами- ногликаны в качестве фармакологически активного компонента: стеклоглад- ное тело (гиалуроновая кислота), ге- пгрин, хонсурид .(хондроитинсульфат) . Способ применим для определения кера- тансульфага роговицы глаза и гликоза- миногликанов. выделенных из двенадцатиперстных кишок свиней

50

- Ксшорнмагркрооание при в.Капичестцен 1ое определекне

530 ш.«основного действующего

вещества по калибровочной кривой и формуле.

Для каждого глнкопротеина установ- оптимальные условия гидролиза. Эта необходимость объясняется тем, что устойчивость к кислотам данной гликозидной связи зависит ох природы Сахаров, участвующих в образовании связи, и от положения связи по отно шению к агликону.

В предлагаемом способе такими оптимальными условиями являются: для гепарина и гликозаминогликанов, вы55

Прибавлеггне1,5%-ного раствора аЦетилацетоиа в бикарбонате натрия

добавлеш1е 3TIlJlOlJOrO

croipra t: 10

деленных из двенадцатиперстных кншок свиней-гидролиз А н. соляной кислотой в течение 3 ч при для хон- сурида (хондроитинсульфат) те же условия, но температура гидролиза 120 С для кератансульфата из роговицы глаз жив.отньк-время гидролиза 18 ч, температура гидролиза 120°С; для стекловидного тела (гиалуроновая кислота) - время гидролиза 3 ч при 118°С,

Пример 1. Проводят отбор пробы препарата гепарин - 10 мг (точная навеска), Отобранную пробу количественно переносят в пробирку с притер- той пробкой. Прибавляют 5 мл 4 н,соляной кислоты. Пробирку плотно закры вайт и нагревают в термостате при в течение 3 ч. 5 мл полученного гидролизата количественно перено- сят в мерную пробирку вместимостью 10 m. Доводят объем гидролизатора водой до 10 МП (V,,). 5 мл полученного раствора (Vj) нейтрализуют до рН 6,0 по Oj1%-HOM раствору метилро та или по универсальной индикаторной бумаге, прибавляя вначале 2,4 мп4 н, раствора едкого натра., а затем 2 капли 0,1 н, раствора едкого нат.у-а. Отмечают конечньш объем нейтрализован- ного гидролизата з пробирке (V). К оставшимся 5 мп раствора ттрибавляют 2,4 мл 4 н, раствора едкого натра и 2 капли 0,1 н, раствора ег;кого натра Из каждой пробирки отбкрают по 1 ш нейтрализованного идролизата (V) и помещают в высокие пробирки вместимостью 25 мл с притертыми пробками и доводят объем раствора водой до 2 мл, прибавляют по 2 мп раствора ацетилацетона. Пробирки закрывают и помещают на водяную баню 97 + 1 С на 20 мин. Во избежание испарения ацетилацетона верхний конец пробирок должен быть значительно выше уровня .воды. Быстро охлаждают раствор до комнатной температуры и прибавляют до 20 мл этилового спирта 95%j тщательно перемешивают и приливают по 2 МП смеси парадиметиламинобензаль- дегида, концентрированной соляной кислоты и этилового .спирта 0,08:1:1,,5 (реактив Эрлиха). Содержание пробя- рок тщательно перемешивают для удаления пузырьков углекислого газа, - Через 45 мин измеряют оптическую плотность растворов на фотоэлектро- колориметре с максимумом п.оглощения при 530 нм в кювете с толщиной слоя

t см. Измерение проводят против контрольной пробы. Контрольную пробу готовят одновременно с опытной: в про бирку с притертой пробкой помешают 2 мл воды к 2 МП раствора ацетилацетона. Пробирку закрывают и помещают на водяную баню 97 j 1°С на 20 QШ, Далее проводят определение как описано. На фотоэлектрокелориметре находят разность между оптической плотностью опытной пробы и оптической плотностью контрольной пробы, она . Составляет 0,364, По калибропочному гр афикуз построенному прк использовании раствора стандартного образца гек созамирш, нахоцят количество гексозд- MiiHa в 1 мл пробы, оно составляет 0,113 f-m,

Содержание гл11коза -п1ногл тконов (по гексоэаьшну) в препарате гепарин в процентах (Х) определяют по формуле

X

а . V.

Y.

iOO %,

где С 0,13 мг; V, 7,6 м.п; V 10 мп; ii - 10 мг,- V - 5 ил; V 1 wi; х, 17,2 %,

И р и к ер 2„ Проводят отбор пробы препарата хонсурид - 10 мг (точная навеска). Далее поступают как описано в примере 1 за исключеютем того, что температура гидролиза 120°С и объем нейтрализованного гицрс.-лизата, взятьй для реакции. 0,5 мл (V), На ФЭКе находят разкость методу оптической плотностью опытной пробы и опти- чесхой плотностью контрольной пробы, она составляет 0,278, По калибровочному графику находят количество гек- созамина в 1 мл пробы, оно составляет 0,0860. Содержание хондроитинсуль- фата в препарате хонсурид (по гексо- замин О определяют по формуле и оно составляет 26-20%,

П р и м е р 3, Проводят отбор пробы препарата стекловидное тело - 4 мл препарата. Далее поступают, как описано в примере 1, за исключением того, что гидролиз проводят 4 мл 8 н, раствора соляной киспоты при 118 С, после нейтрализации объем нейтрализованного гидролизата доводят до 10 hin (V ) , объем нейтрализованного гидролт- эата, взятый для реакции, 2 мп (4). На ФЭКе находят разность между оптичес кой плотност1;:о ОПЫТНОЙ пробы И оПтической контрольной пробы, она составляет 0,168, По калибровочной кривой находят количество гексозамина в 1 ivtn пробы, оно составляет 0,052. Содержание гаилуроновой кислоты (по гексо- замину) в препарате стекловидное тело определяют по формуле и оно составляет 13,1%.

В сравнении с известным способом, продлагаемый способ проще (отсутствует стадия отгонки 2-метилпиррола) и обладает более высокой точностью (оишбка определения 0,82%, в известном способе - 30%),

Формула изобретения

Способ определения гексозаминов в медицинских препаратах путем отбо- ра пробы .препарата, гидролиза соляной кислотой, нейтрализации, добавления к гидролизованной пробе ацетилацето- на, приготовленного на карбонате натрия, нагревания, охлаждения, добав- ления реактива Эрлиха и этилового спирта с последующим колориметриро- ванием, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа за счет сокращения числа трудоемких операций, гидролиз проводят при температуре 115-120 С,

используют 1,5%-HbDi раствор ацетила- цетона в бикарбонате натрия, к гидро- лизату дополнительно добавляют этиловый спирт в объемном соотношении

1:10, используют реактив Эрлиха, содержащий п-диметйламинобензальдегид, концентрированную соляную кислоту и этанол в объемном соотношении 0,08:

:1:1,5, при этом количественное содержание гексозаминов опредапяют по формуле

С .100,

а . V, . V4

де X - содержание гексозаминов, %;

С - количество гексозамина в 1 мл, найденное по калибровочному графику;

а - навеска медицинского препарата, мг;

V, - объем нейтрализованного гидролизата, мл;

V - объем разбавленного гидролизата перед нейтрализацией, мл;

V - объем гидролизата, взятый для нейтрализации, мп;

V - объем нейтрализованного гидролизата, взятый для реакции, мл.