Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L.,используемый для получения моноклональных антител к @ -цепям иммуноглобулинов человека и обезьян Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

СП

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине для тестирования патологических состояний человека, а также для работ в области приматологии.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (М СД) к общей приматовой детерминан- те X -цепи иммуноглобулинов человека и обезьян.

Штамм получают гибридизацией спле- ноцитов мышей линии BALB/c, иммунизированных секреторным IgA из молозива человека, с клетками миеломы X63-Ag 8.653. Слияние проводят с помощью ПЭГ 6000.

Отбор клонов ведут на селективной среде ГАТ и выявляют клоны нужной специфичности. Перспективный штамм-IT ыводят в массовую культуру, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток поз- веночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 91D.

КультурАльные признаки. Среда культивирования - среда RPM1-1640 с 15% эмбриональной телячьей сыворотки, Клетки культивируют при 37 С в 5% СО. Посевная доза 5-10 кл/мл; кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня. Для выращивания клеток используют стеклянные или пластиковые флаконы на 50-250 мл. Мышам линий BALB/C, обработанным приставом, вводят 5-10 млн гибридных клеток, асцит образуется через 10

20 дней.

Продуктивность штамма. Концентра- ция МКА в культуральной жидкости составляет около 10 мкг/мл, асцитичес- кой - 10 мг/мл. Титр МКА в культу- ральной жидкости , асцитической - 10 при определении твердофазным иммуноферментным методом. Стабильная продукция антител сохраняется в течение 10 пассажей in vitro.

Характеристика полезного продукта МКА относятся к классу Ig 62а, они взаимодействуют с общей приматовой детерминантой Л -цепи иммуноглобулинов человека и обезьян. МКА преципи- тируют иммуноглобулины человека в присутствии ПЭГ-6000 (реакции встреч ной и радиальной иммунодиффузии).

S

0 5

о

5

0

0

.

Контаминация. Контаминация бактериями, грибами и микоплазмой не обнаружена. .

Криоконсервирование 5-6-10 клеток замораживают по программе в жидком азоте. Среда консервирования - эмбриональная телячья сыворотка и ди- метилсульфоксид. Жизнеспособность клеток после размораживания 90%.

Пример 1. Навески иммуноглобулинов IgG, IgA и IgM в количестве 15 мкг на трек кипятят на водяной бане в течение 5 мин в буфере, содержащем меркаптозтанол. При этом происходит разрушение дисульфидных,связей и при электрофорезе иммуноглобулины разделяются на составляющие их полипептидные цепи. Электрофорез проводят на 5-20% градиентных полиакриламидных гелях при постоянной силе тока, в двух параллельных образцах. Половина геля окрашивается красителем Кумасси голубым для визуализации белковых полос, из другой половины геля белки элюируют электроперекосом на лист нитроцеллюлозы, обладающей способностью сорбировать белки за счет физической адсорбции. Полученньй лист нитроцеллюлозы или блот блокируют в растворе 8%-ного сухого молока для блокирования всех незаполненных адсорбционных точек бло та. Блот инкубируют 2 ч при 37 С с культуральной жидкостью, содержащей МКА, а затем с антимышиным пероксидазным конъюгатом, который связывается с МКА. После отмывки несвязавшегося конъюгата блок инкубируют с раствором диаминобензидина. Пероксидаза в присутствии перекиси водорода переводит диаминобензидин в окрашенное соединение. В результате на блоте появляется окрашенная полоса только в тех местах, где МКА взаимодействуют со своим антигеном. При этом выявляют легкие цепи Ig с м.м. 25 KD.

П р и м е р 2. В лунки 96-луноч- ной панели вносят параллельно сыворотки приматов в разведении 1:1000. После инкубации в течение 16 ч при 4 С белки сорбируются на пластине лунок. Незаполненные адсорбционно- активные точки блокируют 8%-Hbw раствором.сухого обезжиренного молока, промывают и в каждую лунку вносят определенное разведение МКА или поли- клональной ан исыворотки. После инку- 1442545

бации в течение 1 ч при несвя-МКА или антител поликлональной антиэавшиеся антитела удаляют отмывкойсыворотки.

и вносят разведение 1:1000 перокси- Использование МКА показывает, что

дазного антимышиного конъюгата, ин-уровни иммуноглобулинов в сыворотке

кубируют 1 ч при 37 С и отмывают не-обезьян варьируют от 65 до 105% от

связавшийся конъюгат. В лунки залива-таковых у человека,

ют раствор субстрата - орто-дианизи-Формула изобретения

дина, который пероксидата в присутст- Штамм гибридных культивируемых

ВИИ перекиси водорода переводит в юклеток животных MuS musculus L. ВСКК

окрашенное соединение. Интенсивность,(П) № 91D, используемый для получеизмеренная при 492 нм, пропорциональ-ния моноклональных антител к Л-цепям

на количеству связавшихся с антигеномиммуноглобулинов человека и обезьян.

Изобретение относится к биотехнологий и может быть использовано в медицине для тестирования патологических состояний человека. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток. животных Mus muscules, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к общей приматовой детерминанте 51 - цепи иммуноглобулинов человека и обезьян. Штамм получают гибридизацией спле- ноцитов мьшей линии BALB/c, иммунизированных секреторным Ig А из молозива человека, с клетками миеломы X63-Ag 8,653. МКА относятся к классу Ig 62а и преципитируют Иммуноглобулины человека в присутствии ПЭГ-бООО.Концентра- ция МСА в культуральной жидкости составляет 10мкг/мл, асцитической - 10 мг/мл. Использование МКА показывает, что уровни иммуноглобулинов в сыворотке обезьян варьируют от 65 до 105% от такОвых у человека. (Л С