Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител К 1G А человека и высших обезьян Советский патент 1990 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

Изобретение относится к биотехно-- логии и мс1жет быть использовано для диагностики рака носоглотки.

Цель изобретения - получение штам ма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирующих моноклональ- ные антитела (МКА) к общей антигенной детерминанте человека и высших обезьян.

Штамм получают следующим образом. Спленоциты мьш1ей линии Ва1Ь/с, иммунизированных секреторным IgA человека, сливают с клетками миеломы Х63- Ag 8.653 с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000.

Селекцию клонов ведут на среде ГАТ. Клон, имеющий равную реактивность с IgA человека и высших обезьян, вьшодят в массовую культуру и обозначают Ag-. Штамм А хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером ВСКК/П/ 89D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Стандартные усло вия выращивания: среда RPMI-1640+15% сыворотки плода коровы, 37 С; газовая фаза - воздух + + 5% СОа.

Клетки культивируют в стеклянных или пластиковых флаконах на 50 - 250 мл, посевная доза - 500000 кл/мл;

4:

СЗ

с©

кратность рассева 1:2, время субкультивирования 3-4 дня.

Характеристика культивирования гибридомы в организме животного: мыши Balb/c, обработанные пристаном (1 мл в/б за 10 дней до инокуляции), доза инокуляции - 5-10 млн клеток, время образования асцита 10-20 дней.

Продуктивность штамма.

Концентрация полезного продукта в культуральной среде около 10 мкг/мл, в асцитной жидкости - около 10 мкг/мл,титры данных антител при определении с помощью твердофазного иммуноферментного метода около 10 (среда) и 10 (асцит) цри концентрации антигена 1 мкг/мл. Определение МКА проводят также иммунофлгоорес- центными и радиоиммунологическими методами. Продукция моноклональных антител стабильна по крайней мере в течение 10 пассажей in vitro.

Характеристика полезного продукта.

МКА относятся к классу IgG, они направлены к тяжелой цепи IgA человека и высших обезьян,

МКА преципитирзтат IgA человека в присутствии ПЭГ-6000 (реакция встречной и радиальной иммунодиффу- зии). Константа ассоциации МКА с IgA человека составляет 2, М, с IgA обезьян - 5-10 М.

Контаминация.

Бактерии, грибы и микоплазмы „отсутствуют. Родительская линия X63-Ag 8.653 продуцирует эндогенный ретрови- рус С-типа мышей.

Криоконсервирование.

5-6 млн. кл. замораживают в жидком азоте в присутствии 90% сыворотки плода коровы и 10% DMSO. Жизнеспособность клеток после разморажива- 1ШЯ составляет 90% (по включению трипанового синего).

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример..

Навески иммуноглобулинов всех ютассов человека в количестве 15 мкг на трек кипятят в течение 5 мин на водяной бане в буфере для нанесения,, содержащем меркаптоэтанол. При этом происходит разрушение дисульфидных связей и при электрофорезе иммуноглобулины разделяются на составляющие их тяжелые и легкие цепи. Электрофорез выполняется в двух параллель. ных образцах. Половина геля окрашивается красителем Кумасси голубым для визуализации белковых цепей, из дру- гой половины геля белки элюируют электропереносом на лист нитроцеллюлозы, которая обладает способностью сорбировать белки за счет физической адсорбции. Полученный лист нитроцел- JQ люлозы или блот блокируют в растворе 8%-ного сухого обезжиренного молока для блокирования всех свободных адсорбционно активных точек нитроцеллюлозы. Блот инкубируют 2 ч при 15 с культуральной жидкостью, содержащей МКА, отмывают от несвязавшихся МКА и инкубируют 2 ч при с анти- мьплиным пероксидазным конъюгатом, который связывается с МКА. После отмыв- Q ки несвязавшегося конъюгата блок инкубируют с раствором диаминобензиди- на, Пероксидаза в присутствии перекиси водорода переводит диаминобен- зидин в окрашенное соединение. В 5 результате на блоте появляются окра- шенные полосы только в тех местах, - где МКА взаимодействуют со своим антигеном, в данном случае - тяжелыми цепями IgAi Резуль таты исследований ,Q свидетельствуют о высокой специфичности полученных МКА к тяжелым цепям IgA человека и высших обезьян.

Пример 2. Клетки, продуцируг шщие Эшптейн-Барр-подобный вирус (ЭБВ), фиксируют на стеклах для иммунофлюо- ресцентного анализа. В точке, где находятся фиксированные клетки, добавляют каплю сыворотки больного или После инкубации

ч стекла промывают для удаления несвязавшихся антител. Стекла далее инкубируют с разведением МКА, продуцируемых штаммом AJ, в течение 1 ч при 37°С. После от- , мывки стекла инкубируют с антимышинным конъюгатом ФИТЦ-антитело (флю- оресцеин-изотиоцианат) с последующей отмывкой для удаления несвязавшёг о- ся коньюгата. Те сыворотки, которые содержат IgA к ЕБВ, при просмотре стекол в УФ излучении под микроскопом демонстрируют зеленую иммунофлю- оресценцию. Число флюоресцирующих клеток и интенсивность окраски пропорциональны содержанию антител в сыворотке больных раком носоглотки.

Всего исследовано .25 сывороток больных раком носоглотки и 50 (;ыво5

0

здорового донора, при 37 С в течение

0

5

5 14609946

роток здоровых доноров, у всех боль-ки по наличию сывороточного антиЭБВ

ных раком носоглотки с помощью МКАIgA.

четко идентифицируют IgA против ЭБР,Формула изобретения

в то время как положительных резуль-Штамм гибридных культивируемых

татов не получают с сыворотками здо- клеток животных Mus nmsculus ВСКК

ровых доноров. Таким образом, полу-(П) N89D, используемый для получения

ченные МКА можно эффективно исполь-моноклональных антител к IgA человезовать для диагностики рака носоглот-ка и высших обезьян.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики рака носо глотки. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных, продуцирую1дих монокло- нальные антитела (ММ) к общей антигенной детерминанте IgA человека и высших обезьян. Штамм получают гибри- .цизацией спленоцитов мьшей линии BALB/C, иммз -низированных секреторным IgA человека, с- клетками миеломы X63-Ag8.653. Концентрация МКА в куль- туральной жидкости составляет 10 мкг/ /мл, в асцитической - 10 мкг/мл. МКА относятся к классу IgG, они направлены к тяжелой цепи IgA человека - и высших обезьян. МКА преципитируют IgA человека в присутствии полиэти- ленгликоля м.м. 6000. Константа ассоциации МКА с IgA человека составляет 2,2. М, с IgA обезьян - 5ЧО м,