Способ получения моноклональных антител к легким @ -Цепям иммуноглобулинов человека Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

4iii О

ьа

Р)

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний человека,

Цель изобретения - повьппение чистоты целевого продукта.

Способ заключается в том, что в , качестве источника моноклональных антител используют штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ЗД5Е4 или штамм гибридных культивируемых клеток животных: Mus musculus 6Е7Д7.

I Штамм ЗД5Е4 получают следующим .об-

разом.

; { Ьзцпей линии-BALB/C иммунизируют ; внутрибрюшинным введением 100 мкг легких -цепей человека, вьщеленных из мочи в 6,5 мл физиологического I раствора, забуференного фосфатами I (ЗФР) (5 мМ Na-фосфатньш буфер, рН ; 7,2-7,4, 150 мМ NaCl) без адъюванта, I Иммунизацию повторяют через 40 дней, I вводя внутрибрюшинно 100 мкг легких I -цепей (препарат Lk) в ЗФР без адъ- юванта. Через 3 дня после этого 1 ч

в

: ;tlO клеток селезенки иммунных мьшей гибридизуют с 6-10 клеток миеломы мьшш X63-Ag 8-653 с помощью 0,4 мл 45%-ного раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. массы 2000, содержащего 10% диметилсульфоксида, в течение 1 мин. После гибридизации и отмьшки : клеток от ПЭГа клетки высевайт в |96-луночные панели по 2-10 клеток, . в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду RPMI- 1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% телячьей эмбриональной сыворотки 10 М гипоксантина, 4-10 М аминопте рина и 1,6-10 М тимидина.Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по I клет ке в лунку, содержащую 4-10 клеток селезенки. После двутс клониройаний практически 100% субклонов продуцируют антитела к легким,ф-цепям иммун у-лобулинов человека.

Наиболее продуктивный клон выводя S массовую культуру и обозначают ДЗЕ4. Штамм ЗД5Е4 хранится в специ- 4лизированной коллекции перевиваемых Соматических.клеток позвоночных Ин- . с|титута Цитологии АН СССР под номеро В;СКК(П) 72Д и характеризуется сле- ющими признаками.

0

5

Q

5

5

0

0

0

Культуральные приз.наки.

Среда культивирования - среда RPMI-I640 или DMEM с 10% донорской телячьей сыворотки, 4 мМ L-глутами- на, 100 мкг/мл пенициллина, 100мкг/мл стрептомицина, 0,05 Ш меркапто- этанола. Для выращивания штамма используют пластиковую лосуду, посевная доза 10 Кл/мл, клетки выра- щивают при 37°С в атмосфере 5% COg, пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная.

Для вьфащивания асцита пригодны мьшги BAI3/C. Мьшам за 7-30 дней до инъекции клеток вводят внутри- брющинно 0,5 мл пристана.

Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5-10 Кл/мл среды Игла. Асцит формируется через 12-14 дней.

Продуктивность штамма. Секреция моноклональных антител (МКА) на 34день культивирования составляет 10- 15 мкг/мл культуральной среды и 35мг/мл асцитической жидкости. Продукция антител сохраняется до 20 пассажей in vitro и 3 in vivo.

Характеристика полезного продукта МКА ЗД5Е4 относятся к IgM классу.Они специфически связываются с легкими эе-цепями иммуноглобулинов человека.

Контаминация.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки.

Криоконсервирование.

Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания; 4 с в минуту до 4 С, затем I С в минуту до . После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

Штамм 6Е7Д7 получают следующим образом.

Мышей линии BaLB/c иммунизируют внутрнбрюшинным введением i 00 мкг легких ее-цепей человека, выделенных из мочи в 0,5 мл физиологического раствора, забуференного фосфатами (ЭФР)

(5 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,2-7,4, 150 bdt KaCl), без адъюванта. Иммуни- ациго повторяют через 40 дней, вводя . нутрибрюшинно 100 мкг легких ее-цепей j (препарат Lk) в ,ЗФР без адъюванта. ерез 3 дня после этого 1-10 клеток селезенки иммунных мышей гибриди- зуют с 6-10 клеток миеломы мьши X63-Ag 8-653 с помощью 0,4 мл 45%-но-10 го раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) мол. массы 2000, содержащего 10% ди- метилсульфоксида, в течение 1 мин, После гибридизации и отмьшки от ПЭГа клетки высевают в 96-луночные панели 15 по 2-10 клеток в лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду BPMI-1640 с добавлением 10% лошадиной и 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 10 М гипоксанти-20 на, 4-10 М аминоптерина и 1 6-10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по I клетке в лунку, содержащую 4-10 клеток селезенки. После 25 двух клонирований практически 100% субклонов продуцируют антитела к лег- . КИМ де-цепям иммуноглобулинов человека. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают 30 6Е7Д7. Штамм 6Е7Д7 хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером ВСКК(П) 71Д и характеризуется следу- 35 ющими признаками.

Культуральные признаки. Среда культивирования - среда RPMi-i640 или DMEM с 10% донорской телячьей сыворотки, 4 мМ Ъ-глутами- 40 на, 100 мкг/мл пенициллина, 100мкт/мл стрептомицина, 0,05 Ш меркаптоэтано- ла. Для выращивания штамма используют пластиковую посуду, посевная доза 10 Кл/мл, клетки выращивают при 37°С 45 а, атмосфере 5% СО, пассируют один раз в 3-4 дня кратность рассева 1:10, Культура суспензионная. Для выращивания асцита пригодны мыши BALB/c. МмА, шам за 7-30 дней до инъекции клеток JQ штамма вводят внутрибрюшинно 0,5 мл . пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2-5 -10 КЛ/МЛ среды Игла, Асцит формируется через дней.

Продуктивнбсть штамма. Секреция моноклональных антител (МКА) на 34 день культивирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асцитической жидкости Продукция антител сохраняется до 20 пассажей in vitro и 3 in vivo.

Характеристика полезного продукта, МКА 6Е7Д7 относятся к Ig61 классу. Они специфически связываются с легкими эе-цепями иммуноглобулинов человека.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимиди- новой метки.

Кряоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: в минуту до 4 С, затем 1 С в минуту до -40 С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание - на водяной бане при З7 с. Жизнеспособность клеток после размораживания 70- 80% по окрашиванию трипановьпч синим.

П р им ер. Гибридомнь1е клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 кв.см по 5-10 клеток в 5 мл среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, 4 мМ глютамина, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл

стрептомицина, 0,05 мМ.меркаптоэтано- ла. Клетки культивируют 2-3 дня при 37 С в атмосфере 4% СО. Получеиньй супернатант используют в качестве

реагента в ш мунологических реакциях

(как препарат МКА). МКА тестируют с

помощью радиоиммунного аналнза.

На полистирольные 96-ячеечныё панели для микротитрования сорбируют антиген - 2 мкг на ячейку в 100 мкл ЗФР при 4 С в течение ночи. После на- сьш1ения панелей 0,05%-ным раствором Твин-20 в ЗФР для уменьшения неспецифического связывания антител с пластиком, в ячейки вносят по 100 мкл

культуральной среды штаммов ЗД5Е4 и 67ДЕ7 к инкубируют 1 ч при . После этого панели отмьшают три раза по 250 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 и вносят кроличьи антимышиные антитела меченые I по методу Бейля и др. (препарат с удельной активностью 1,1-10 срт на мкг, по 0, орт в 100 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 на

лунку для штамма 67ДЕ7 к с активностью 0,9-10 срт на мкг, по 0,2 : 10 срт в 100 мкл ЗФР с 0,05%-ным Твин-20 на лунку для штамма ЗД5Е4),

После инкубации в течение 1 ч при панель.промьгоают ЗФР с 0,05%-ным я просчитывают на счетчике.

Результаты исследований представлены в таблице (цифры приведены за йычетом сорбции меченых антител после инкубации антигена с нормальными им- йуноглобулинами мыши),

: Реззтаьтаты приведенные в таблице, Свидетельствуют о том, что МКА ЗД5Е4 6Е7Д7 специфически взаимодействуют 4 легкими es-цепнми иммуноглобулинов Человека.

I Повышение их чистоты достигается 9ja счет того, что в качестве партне- р|а для гибридизации при получении С., mlraMMOB ЗД5Е4 и 6Е7Д7 используют ли, нию X63-Ag8-653, не синтезирующую иммуноглобулинов или их легких цепей,

Формула изобр е тения

Способ получения моноклональных антител к легким ае-цепям иммуноглобулинов человека, заключающийся в культивировании гибридомы в питательной среде с последующим вьщелением и очисткой целевого продукта, о т л и ч а- ю чц и и с я тем, что J, с целью повьше- ния чистоты целевого продукта, в качестве гибридомы используют штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus, musculus BCKK(n)N7lD или штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus, musculus BCKK(n)N72D,

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для диагностики аутоиммунных заболеваний человека. Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта путем использования в качестве источника моноклонапьных антител (МКА) штамьюв гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ЗД5Е4 или 6Е7Д7. Штаммы ЗД5Е4 и 6Е7Д7 получают гибридизацией спленоцитов мышей BALB/C, иммунизированных легкими д&- цепями иммуноглобулинов человека, с клетками миеломы X63-Ag 8-653. Оба штамма культивируют на среде RPMI 1640 с добавлением 10% донорской телячьей сыворотки, пассируют один раз в 3-4 дня с кратностью рассева 1;10. Способ осуществляют, культивируя штаммы ЗД5Е4 и 6Е7Д7 в питательной сред е, выделяя целевой продукт и тестируя его на специфическое взаимодействие с. легкими ее-цепями иммуноглобулинов человека. Повышение чистоты целевого .продукта достигается использованием в качестве партнера для гибридизации при получении штаммов ЗД5Е4 и 6Е7Д7 . миеломы X63-Ag 8-653, не продуцирующей иммуноглобулинов или их легких цепей. 1 табл.

IgG3 Н&т(зе) IgG4,Tar(«6) IgM В en (50) IgE(se) Ig A2()

окрашивания нет

4- -I- -(Ig A к) Ig ) IgG3 ИЛ(5&) IgG4 ЖБЛ() IgGA БРО(э&) IgM. БОБ(эе)

Качественные данные получены методом ELISA с применением конъюгата пероксидазы с кроличьими антимышиньщя, антителами.

Н.И

н,и

Н.И Н.И,