Штамм гибридных культивируемых клеток животных мUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к J @ G человека и высших обезьян Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медико-биологических исследованиях.

Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МКА), обладающие равной реактивностью с IgG человека и высших обезьян.

Штамм получают следующим образом.

Спленоциты мьпией линии BALB/c, иммунизированных IS- глобулином человека, гибридизуют с клетками миеломы X63-Ag8.653 с помощью полиэтилен- гликоля (ПЭГ) м.м. 6000. Сел.екцию клонов ведут на среде ГАТ. Клон, имеющий равную реактивность с IgG

2

человека и высших обезьян, выводят

в массовую культуру и обозначают G. Штамм GJ хранится в Специализированной коллекции перевиваемых сомати- чес ких клеток позвоночных Института Цитологии АН СССР под номером BCKK(II) 90Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия выращивания - среда-, RP r -1640+15% сьшоротки плода коровы, , газовая фаза - воздух +5% COj .

Клетки культивируют в стеклянных или пластиковых флаконах на 50-250 мл, посевная доза - 500000 кл./мл; крат ность рассева 1г2, время субкультивирования 3-4 дня.

to

4 СЛ 4

00 ел

31454850

Характеристика культивирования в са. Нитроцеллюлоза обладает способорганизме животного: мьппи линии BALB/C, обработанные простаном (1 мл, внутрибрюшинно за 10 дней до инокуляции} , доза инокуляции 5-10 млн. кл., время образования асцита 10-20 дней. Продуктивность штамма. Концентрация полезного вещества в культуральностью удерживать белки на своей поверхности за счет сил физической адсорбции. Нитроцеллюлозу, или так называемьй блот, инкубируют в 8%-ном рвстворе обезжиренного сухого молока для блокирования всех незаполненных адсорбционных точек. Затем блот инной среде составляет около 10 мкг/мл, ю кубируют в течение 2 ч при 37°С в в асцитной жидкости около 10 мг/мл. разведении асцитной жидкости 1:100. Титры МКА при определении с помощью

твердофазного иммуноферментного мето. J .

да: 2-10(культуральная среда) и

После отмывки для удаления несвязавшихся МКА блот инкубируют с меченным пероксидазой конъюгатом против мыши20

Hcli I . yjlD 1 у iJaJiD n. ,b - жг-1

(асцит) при концентрации антиге- 15 ных иммуноглобулинов в течение 2 ч на I мкг/мл. Продукция МКА стабиль- при 37°С. Блот отмывают, иммуноопре- на, по крайней мере, в течение 10 деляемые полосы визуализируют рбработ- пассажей in vitro. Характеристика по- кой с субстратом - диаминобензидином. лезного продукта:МКА относятся к классу IgGso. они направлены против класс-специфической детерминанты константного региона тяжелых цепей IgG человека и высших обезьян; специфичность оценивается иммуноферментным, радиоиммунологическим и модифицированными иммунодиффузионными методами. МКА преципитируют IgG человека « высших обезьян в присутствии ПЭГ-6000

(реакция встречной и радиальной имму- . нодиффузии) . Контаминация, Бактерии, ЗО деления уровня IgG в сыворотках чело- грибы и микоплазмы отсутствуют, Ро- . века и шимпанзе, взятых в разведении дительская линия X63-Ag.8.653 проду- 1:1000, методом твердофазного иммуноКонъюгат в присутствии перекиси водорода превращает диаминобензидин в окрашенное соединение. Только те белковые полосы, которые взаимодействуют с МКА, становятся видны на блотах.

Результаты исследований свидетель- 25 ствуют о высокой специфичности полученных МКА к тяжелым цепям IgG человека и высших обезьян.

П р и м е р 2. МКА, продуцируемые гибридомой G, используют для опрецирует эндогенный ретровирус С - ти па мышей. Криоконсервирование. 5ферментного анализа. Параллельно те же сыворотки тестируют с использована МЬШЗеИ. КрИОКОНСерВИриОаППС . Jже СЫВириТЛИ ICU injJytU 1 V- . млн. кл. замораживают в жидком азо-.jg нием поликлональной антисыворотки, те в присутствии 90% сыворотки плода направленной к тяжелым цепям IgG че- коровы и 10% DMSO. Жизнеспособность

ловека. В лунки 96-луночной панели вносят разведения каждой из 10 взятых сывороток человека и шимпан- 40 зе. При этом белки, находящиеся в сыворотках, собирают на пластике лунок. Лунки промывают для удаления несвязавшихся белков: свободные адсорбционные точки лунок блокируют

клеток после размораживания составляет 90% (по включению трипанового синего) .

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Навески иммуноглобулинов всех классов человека в коли (.lupuunwrmoic. -т.чп .

честве 15 мкг на трек кипятят в тече- 45 8%-ным раствором сухого обезжиренно- ние 5 мин на вЬдяной бане в буфере -- .-,,.,0 R HVHKH вносят для нанесения, содержащем меркапто- этанол. При этом происходит разрушение дисульфидных связей молекулой ..

они разделяются в виде единичных по- Q цепями IgG. После инкубации при 37 С

липептидных цепей. Образцы исследуют - - -.-...,.о„ „„.

в двойном количестве параллельно на одном и том же геле. Одну половину геля окрашивают с помощью красителя

го молока, после чего в лунки вносят либо разведения МКА 1:5000, либо поликлональные антитела, меченные пероксидазой, реагирующие с тяжелыми

в течение 1 ч лунки промывают для удаления несвязавшихся антител. Затем в лунки вносят антимышиный перокси- дазный конъюгат и панели инкубируют

rGJi vJ iS.y о-Шгагз cirv iv 4-w i- - LMi ----i-r --

Кумасси голубого, который окрашивает g в течение 2 ч при 37 С. После отмывки

. ..„.,(4 tlO CTt,

все белковые полосы, присутствующие в геле. Из второй половины геля белковые полосы переносят на листы нитроцеллюлозы с помощью электроперенов лунки добавляют раствор о-фенилен- диамина, который пероксидаза в присутствии перекиси водорода превращает в окрашенное соединение. Степень

са. Нитроцеллюлоза обладает способностью удерживать белки на своей поверхности за счет сил физической адсорбции. Нитроцеллюлозу, или так называемьй блот, инкубируют в 8%-ном рвстворе обезжиренного сухого молока для блокирования всех незаполненных адсорбционных точек. Затем блот инкубируют в течение 2 ч при 37°С в разведении асцитной жидкости 1:100.

кубируют в течение 2 ч при 37°С в разведении асцитной жидкости 1:100.

После отмывки для удаления несвязавшихся МКА блот инкубируют с меченным пероксидазой конъюгатом против мыши - жг-1

ных иммуноглобулинов в течение 2 ч при 37°С. Блот отмывают, иммуноопре- деляемые полосы визуализируют рбработ кой с субстратом - диаминобензидином.

0

5 ных иммуноглобулинов в течение 2 ч при 37°С. Блот отмывают, иммуноопре- деляемые полосы визуализируют рбработ- кой с субстратом - диаминобензидином.

. Конъюгат в присутствии перекиси водорода превращает диаминобензидин в окрашенное соединение. Только те белковые полосы, которые взаимодействуют с МКА, становятся видны на блотах.

Результаты исследований свидетель- 25 ствуют о высокой специфичности полученных МКА к тяжелым цепям IgG человека и высших обезьян.

П р и м е р 2. МКА, продуцируемые гибридомой G, используют для определения уровня IgG в сыворотках чело- века и шимпанзе, взятых в разведении 1:1000, методом твердофазного иммуноферментного анализа. Параллельно те же сыворотки тестируют с использоваже СЫВириТЛИ ICU injJytU 1 V- .- - нием поликлональной антисыворотки, направленной к тяжелым цепям IgG че-

ловека. В лунки 96-луночной панели вносят разведения каждой из 10 взятых сывороток человека и шимпан- зе. При этом белки, находящиеся в сыворотках, собирают на пластике лунок. Лунки промывают для удаления несвязавшихся белков: свободные адсорбционные точки лунок блокируют

(.lupuunwrmoic. -т.чп .

8%-ным раствором сухого обезжиренно- -- .-,,.,0 R HVHKH вносят ..

8%-ным раствором сухого обезжиренно- -- .-,,.,0 R HVHKH вносят ..

цепями IgG. После инкубации при 37 С

го молока, после чего в лунки вносят либо разведения МКА 1:5000, либо поликлональные антитела, меченные пероксидазой, реагирующие с тяжелыми

цепями IgG. После инкубации при 37 С

- - -.-...,.о„ „„.

в течение 1 ч лунки промывают для удаления несвязавшихся антител. Затем в лунки вносят антимышиный перокси- дазный конъюгат и панели инкубируют

в течение 2 ч при 37 С. После отмывки

в течение 2 ч при 37 С. После отмывки

..„.,(4 tlO CTt,

в лунки добавляют раствор о-фенилен- диамина, который пероксидаза в присутствии перекиси водорода превращает в окрашенное соединение. Степень

5.14548506

окраски при 492 нм ( ) пропорцио-шимпанзе, но и к детерминантам; присутнальна концентрации IgG в сывороткествующим только на IgG человека, человека и обезьян. Коэффициенты кор- Таким образом, МКА обеспечивают

реляции вычисляют с помощью соответ- более эффективное тестирование общей

ствующей программы на ЭВМ.антигенной детерминанты IgG человека

Коэффициент корреляции между дан-и высших обезьян. ными, полученными с помощью МКА и поликлональной антисыворотки для чело-Формула изобретения веческого IgG, равен 0,96, для IgG ю

шимпанзе - 0,91. Это отражает тот Штамм гибридных культивируемых

факт, что поликлональная антисьшорот-клеток животных Mus musculus BCKK(II)

ка содержит антитела не только к де-№ 90Д, используемый для получения мотерминантам, общим для человека иноклональных антител к IgG человека

и высших обезьян.