Способ коррекции рациона питания кормящих матерей Советский патент 1989 года по МПК G01N33/53 

1

Изобретение относится к медицине, а именно к способам иммунологических исследований, проводимых с целью обоснованного выбора элиминационной диеты для корпящих матерей, дети которых страдают аллергическими заболеваниями.

Цель изобретения - повышение точности способа коррекции рациона кормящих матерей.

Способ осуществляется следующим образом.

Биологические жидкости - сыворотку крови матери и ребенка и грудное молоко - исследуют в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для выявления антител к 10 пищевым белкам: казеину, БСА, 6б-лактальбуминовой и В-лактоглобулиновой фракциям коровьего молока, овальбумину, овомукоиду и общему яичному протеину, глиадино- вой и глютениновой фракциям белков пшеницы и изоляту белков сои, Б груд5 ном молоке с помощью реакции торможения непрямой гемаглютинации (РТНГА) и в реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини определяют антигены (овальбумин и БСА).

10 Для постановки РНГА используют 0,2-0,3 мл сыворотки крови. Сыворотку крови разводят стерильным физиологическим раствором 1:5(0,2 мл сыворотки и 0,8 МП стерильного-- фиJ5 зиологического раствора). Разведенную сыворотку инактивируют в течение 30 мин при +5б с в водяной бане для уничтожения термолабильных антител и комплемента. Затем в пробирку г

4

:п :п

:о

:о

инактивированной сывороткой добавля ют 50%-ную взвесь баранвих эритро1щ- тов без антигена (по 2 капли 50%-ной взвеси на 1 мл разведенной сыворотки) для абсорб1дии гетерогемагглютининов. Пробирку хорошо встряхивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Далее в пробирку добавляют 2 капли 25%-ного раствора каолина для очи- ю считают то ее последнее разведение.

и 1:4 для грудного молока с обязательной постановкой контроля. Резуль таты РИГА учитывают только при наличии 2 отрицательных контрольных исследований. Учет ведется через 2-4 ч по общепринятой 4-крестовой-системе, учитывая характер оседания эритроцитов на две лунки. Титром сыворотки

считают то ее последнее разведение.

и 1:4 для грудного молока с обязательной постановкой контроля. Результаты РИГА учитывают только при наличии 2 отрицательных контрольных исследований. Учет ведется через 2-4 ч по общепринятой 4-крестовой-системе, учитывая характер оседания эритроцитов на две лунки. Титром сыворотки

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологическим исследованиям, проводимым с целью обоснованного выбора элиминаци- онной диеты для кормящих матерей, дети которых страдают пищевой аллергией. Целью изобретения является повышение точности способа. Способ осу-, ществляется следующим образом. В сыворотке крови матери, ребенка и грудном молоке определяют уровень антител к отдельным фракциям молока, яйца, пшеницы, а также выявляют бычий сывороточный альбумин и овальбумин в грудном молоке. Из рациона питания исключают виновные белковые антигены при обнаружении антител к ним в титре 1:40 и выше в сыворотке крови матери и ребенка и 1:8 и выше в грудном молоке. Это в полной мере относится к бычьему сывороточному альбумину и овальбумину, обнаруженному в грудном молоке. (Л

стки от липидных компонентов. Каолином чистят также мутные, долго хра-- нив1пиеся в холодильнике, сыворотки. Еще через 1 ч сыворотку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10- 15 мин. Инактивированную абсорбированную сыворотку хранят в холодильнике не более 2-3 дней, не допуская замерзания.

Образцы грудного молока центрифугируют в течение 30 мин при 5000 об/мин. Удаляют молочный жир и осторожно,чтобы не попали частицы жира, отбирают молочную сыворотку. Груд ное молоко разводят физиологическим раствором 1:2 (0,5 мл сыворотки грудного молока и 0,5 мл физиологического раствора). Далее образцы грудного молока обрабатывают так же, как и сыворотку крови, при этом очистка молочной сыворотки 25%-ным раствором каолина от липидов является строго обязательной. В противном случае можно получить ложно положительную реакцию.

Для постановки микромодификации РИГА используют .-шкротитратор систе- мь Такачи, содержащий планшеты для иммунологических реакций, микропереноски и микрокапельницы на 25 мкл.

В.качестве среды для реакции применяют нормальную кроличью сыворотку (НКС) в разведении 1:100, которая обеспечивает необходимый белковый минимум для РИГА.

Рабочие концентрации эритроцитар- ных антигенных диагностикумов: 0,3%- ный об-лактальбуминовый, 0,3%-ньш В- лактоглобулиновый и т.д. Кроме того, используют 0,3%-ный раствор контрольных бараньих эритроцитов, не нагруженных антигеном, для контроля за полнотой абсорбции испытуемой сьшоро ки от нормальньт гетерогемагглютини- нов к бараньим эритроцитам.

РНГА выполняют по общепринятой методике путем двукратного разведения исследуемых образцов начиная с разведения 1:10 для сыворотки крови

которое вызывает агглютинацию эритро-. цитов, нагруженных пищевым антигеном. Устанавливают диагностически значимые титры антител для сыворотки крови 1:40 и выше, для грудного молока 1:8-1:16 и выше.

Пищевые антигены в молоке матерей определяют с использованием одного из 2 методических приемов, в обоих случаях для исследования необходимы гипериммунные кроличьи антисыворотки к указанным антигенам.

Во-первых, используют модифицированный метод определения основных

классов иммуноглобулинов сыворотки крови в реакции простой радиальной иммунодиффузии в агаре. Основное отличие заключается в том, что в агар вносят гипериммунную кроличью антисыворотку против овальбумина или БСА с содержанием антител в титре не ниже 1:5120. В лунки раскапывают по 4 мкл освобожденного от липидов центрифугированием (5000 об/мин в течение

30 мин) грудного молока и в качестве стандарта ряд разведения белка антигена, пластины инкубируют во влажной камере 24 ч при +4 С. Затем измеряют диаметр колец преципитации и

рассчитывают по стандартной кривой концентратщю антигена в мг/100 мл грудного молока. Чувствительность метода 6,5-10 мг/100 мл.

Во-вторых, антигены определяют

в РТНГА. Для проведения этого метода требуются те же материалы и оборудование, что и для РИГА, но вместо испытуемой сыворотки в лунки вносят кроличьи антисыворо(ки к овальбумину и БСА. РТНГА выполняют следующем образом: в 3 ряда лунок на пластине для микротитрования раскапывают по 25 мкл НКС 1:100, далее раститровы- вают кроличью антисыворотку, содержащую антитела к овальбумину или БСА, затем в первый ряд в каждую лунку, кроме двух последних (2 последние лун- ки те же контроля, что и в РИГА), вносят по 25 МК.П грудного молока в раз51А

ведении 1:2 (инактивированного при 5б С и абсорбированного от гетероге- магглютининов 50%-ной суспензией бараньих эритроцитов) и 25 мкп 0,3%- ной взвеси эритроцитарного антигенного диагностикума к овальбумину или к БСА, во второй ряд лунок вносят только 25 мкл эритроцитарного диагностикума к овальбумину или БСА; послед обычного интервала (2-4 ч) учитывают результаты реакции: в контрольных лунках агглютинация должна отсутствовать: во втором ряду выявляется титр используемой кроличьей антисьшо- ротки (например,,1:2560 или 1:5120), а в первом ряду при наличии антигена в исследуемом молоке число лунок с гемагглютинацией уменьшается. Положительным результатом считают сии- жение титра антител в кроличьей антисыворотке не менее чем на 2 разведения. Например, титр антител в кроличьей антисыворотке (2-й ряд лунок) к овальбумину 1:5120, а при добавле- НИИ грудного молока (1-й ряд лунок) титр снизился до 1:1280 или 1:640 - в данном образце грудного молока присутствует овальбумин. Эту реакцию используют для качественного обнаруже- ВИЯ пищевых антигенов в молоке матерей, однако РТНГА при необходимости может быть использована и для количественной оценки.

Пример 1, Ребенок К,, 7 мес находящаяся на смешанном вскармливании (грудное молоко, кефир и овощное пюре), страдает экссудативным диатезом с 1-месячного возраста, кожные проявления аллергодерматоза усили- лись с введением в рацион питания цельного молока и овощного пюре, Ал- лергоанамнез отягощен (мать страдает лекарственной аллергией), После клинического обследования бып постав- лен диагноз истинной экземы, средне- тяжелое течение.

Исследование проводили по предлагаемому способу,

В результате исследования бьти об- наружены антитела в сыворотке матери и ребенка к следующим пищевым антигенам: казеину 1:160 (в сыворотке крови матери 1:320), бычьему сьшоро- точному альбумину 1:40 и яйцу 1:40, При анализе полученных данных выявили, что клиническая картина аллергодерматоза у ребенка обусловлена сенсибилизацией пищевыми антегенами.

196

о чем свидетельствовало наличие ге- магглютинирующих антетел в сыворотке крови, причем имелась наследственная предрасположенность к заболеванию, так как в сыворотке крови ребенка и матери циркулировали одни и те же антитела к пищевым антигенам. Присутствие антител к яичному белку объяснялось достаточным количеством яичного антигена в грудном молоке (ребенок яйца не получал), Назначение эли- минационной диеты ребенку и матери с исключением причинно значимых аллергенов на 2 мес привело к улучшению состояния кожных покровов. Однако и через 2 мес в крови ребенка присутствовали антитела к белкам коровьего молока в низком титре 1:10 и 1:20. Включение в рацион питания сливочного масла, содержащего белки молочной сыворотки, вызвало обострение заболевания. Таким образом, эффективность злиминационной диеты должна контролироваться исследованием триады биологических жидкостей матери и ребенка, так как присутствие антител даже в низких титрах является прогностически неблагоприятным признаком.

Пример 2. Под наблюдением находились 139 детей с кожными проявлениями пищевой аллергии, у 58% из них первые признаки аллергического заболевания появились на чисто грудном вскармливании. При кормлении грудью многие матери употребляли избыточное количество молока и молочных продуктов. Резкое обострение заболевания у части детей возникло при первом введении прикорма в виде молочных каш или кефира. Вначале было исследовано 65 пар мать-ребенок (сыворотка крови матери и ребенка), что соответствовало клинико-лабораторному обследованию детей по способу-прототипу, так как в обоих случаях изучали сен- сибилизацию организма ребенка и матери, в первом случае к пищевым продуктам, протекающую с образованием IgE- антител, во втором случае - к пищевым антигенам с образованием Ig G-анти- тел, которая в большинстве случаев протекала параллельно. Результаты такого обследования позволили выявить в 72,1% случаев причинно зависимуюсвязЬ между аллергическим настроем организма матери и ребенка, особенно при отягощенном аллергоанамнезе. Тем не менее у 27,9% обследованных пар матьребенок такой прямой зависимости не |установлено. В связи с этим у этой Группы детей было проведено комплексле этого назначали патогенетически обоснованную элиминационную диету. Результаты обследования позволили

ное иммунологическое исследование сы- сохранить грудное вскармливание у

воротки крови ребенка и матери, а31 ребенка (66%) после соответствуютакже грудного молока с применениемщей коррекции рациона питания матери

способа диагностики по примеру 1.(снижение или исключение потреблерредлагаемым способом обследовано

ния матерью молока и молочных про147 детей, находящихся в момент иссле- ю дуктов, исключение яиц и облигатных ования на чисто грудном и смешанном аллергенов).Коррекция рациона питания матери не дала желаемых результатов у 16 детей (34%). Поэтому у этой группы детей было исключено грудное 15 вскармливание и назначена безмолочная диета с применением детской питательной смеси на основе сои Изо- в течение 1,5-3 мес. Постепен(преимущественно грудном) вскармлива- 1нии, из общего числа детей с кожными |проявлениями пищевой аллергии. I Для оценки результатов комплекс- |ной диагностики сенсибилизации орга- |низма пищевыми антигенами учитьшали дифференциально-диагностические критерии, разработанные на группе прак- |тически здоровых детей в возрасте от {6 мес до 1,5 лет (24 ребенка) и взрос- IfibK доноров (45 человек) , а также на |пробах грудного молока от 42 практи- |чески здоровых матерей. Титр антител |дяя сыворотки крови от 1:5 до 1:20 |считали слабо выраженной сенсибилиза- цией, что свидетельствовало о проникновении белковых макромолекул через эпителиальный барьер желудочно-кишеч- :ного тракта, для грудного молока :титр антител 1:2-1:4 также считают Анормальным прохождением материнских llgG-глобулинов в грудное молоко. Тит- :ры антител в сьшоротке крови 1:40- 1:80 (умеренно вьфаженная сенсибилизация) и 1:160-1:320 и выше (резко выраженная сенсибилизация), а для грудного молока 1:8-1:16 и .выше считают диагностически значимыми титрами. Наличие антигенов в грудном молоке считают прогностически неблагоприятным признаком. Установлено совпадение степени вьфаженности кожньк проявлений аллергической реакции с предложенными дифференциально-диагностическими критериями. Так, например, частота обнаружения сенсибилизации к яичному протеину, у детей на грудном вскармливании находится в замил

но улучшилась клиническая картина

20 заболевания и исчезли из сьгооротки крови детей антитела к молочным белкам, что позволило расширить рацион детей с учетом их возрастных физиологических потребностей в белках за

25 счет осторожного включения белков говяжьего мяса и кисломолочных смесей. При обследовании по способу-прототипу, если в сыворотке крови обнаруживают специфические IgE-антитела

30 к молоку, яйцам и рыбе, из рациона питания матери полностью исключают указанные продукты, а при выраженности клинических проявлений пищевой аллергии заменяют грудное вскармлива35 ние на специализированные безмолочные смеси на основе растительных белков. Такой подход увеличивает неблагоприятную тенденцию к снижению грудного вскармливания младенцев.

40 Таким образом, необходимым этапом обоснованной коррекции рациона питания матери является диагностика наличия пищевых антигенов и антител к пищевым белкам в грудном молоке и в

45 крови матери,, а также установление их присутствия в крови ребенка на грудном вскармливании. Кроме того, этот метод исследования позволяет выявить такие индивидуальные белки ковисимости от степени тяжести заболе-. 50 ровьего молока или яйца, а также рас- вания. Из представленных материалов тительных продуктов, которые являются причинно значимыми аллергенами в

видно, что с возрастанием степени тяжести заболевания возрастала и час- тота обнаружения диагностически зна- чимых титров к яичному протеину.

Для каждого больного ребенка и матери составляли индивидуальную карту обследования сесибилизации пищевыми антигенами (по примеру. 1) и лишь поскаждом конкретном случае. Это открывает перспективы для технологическо- 55 го изготовления специализированных продуктов детского питания с исключением тех белков, которые наиболее часто вызывают пищевую аллергию при переходе ребенка с грудного вскармлива-.

ле этого назначали патогенетически обоснованную элиминационную диету. Результаты обследования позволили

(снижение или исключение потребления матерью молока и молочных продуктов, исключение яиц и облигатных аллергенов).Коррекция рациона питания матери не дала желаемых результатов у 16 детей (34%). Поэтому у этой группы детей было исключено грудное вскармливание и назначена безмолочная диета с применением детской питательной смеси на основе сои Изо- в течение 1,5-3 мес. Постепенмил

но улучшилась клиническая картина

заболевания и исчезли из сьгооротки крови детей антитела к молочным белкам, что позволило расширить рацион детей с учетом их возрастных физиологических потребностей в белках за

счет осторожного включения белков говяжьего мяса и кисломолочных смесей. При обследовании по способу-прототипу, если в сыворотке крови обнаруживают специфические IgE-антитела

к молоку, яйцам и рыбе, из рациона питания матери полностью исключают указанные продукты, а при выраженности клинических проявлений пищевой аллергии заменяют грудное вскармливание на специализированные безмолочные смеси на основе растительных белков. Такой подход увеличивает неблагоприятную тенденцию к снижению грудного вскармливания младенцев.

Таким образом, необходимым этапом обоснованной коррекции рациона питания матери является диагностика наличия пищевых антигенов и антител к пищевым белкам в грудном молоке и в

крови матери,, а также установление их присутствия в крови ребенка на грудном вскармливании. Кроме того, этот метод исследования позволяет выявить такие индивидуальные белки кокаждом конкретном случае. Это открывает перспективы для технологическо- 55 го изготовления специализированных продуктов детского питания с исключением тех белков, которые наиболее часто вызывают пищевую аллергию при переходе ребенка с грудного вскармлива-.

914

ния на смешанное. Например, и на dc- нове коровьего молока можно приготовить альбуминовое молоко, не содержа- щее В-лактоглобулина, в случае аллергии к яйцу - можно разрешить употребление белка или желтка куриного яйца, что расширяет пищевой ращюн ребенка первых месяцев жизни, при наличии в крови ребенка антител не только к ка- зеину, но и к бычьему сывороточному альбумину элиминационная диета должна строиться с исключением на определенный период не только коровьего молока, но и говяжьего мяса и т.д.

Перспективным является применение предлагаемого способа для контроля за качеством донорского молока, одним из условий качества которого можно было бы считать отсутствие в нем пищевых антигенов как одних из факторов риска развития аллергических заболеваний у детей.

Предлагаемое комплексное иммунологическое обследование матери и ре- бенка определяет выбор такой коррекции рациона питания матери, которая позволяет сохранить грудное вскармливание и является профилактикой возникновения аллергических заболеваний у детей раннего возраста при переходе на смешанное вскармливание. Сохранение естественного вскармливания очень важно для детей первого полугодия жиз1910

ни, так как грудное молоко содержит, помимо пищевых веществ, ряд белков, обладающих защитными свойствами, таких как лизоцим, лактоферрин, секреторный Ig А и т.д.

Ф о р м у л

изобретения

Способ коррекции рациона питар1ия кормящих матерей, включающий забор крови у матери и ребенка, вьщеление из нее сыворотки, определение антител к пищевым продуктам и составление элиминационной диеты, отличающийся тем, что, с целью повьш1ения точности способа, одновременно определяют антитела в грудном молоке, сыворотке крови матери и ребенка к казеину, аб -лактальбуминовой и В-лактоглобулиновой фракций коровьего молока, бьиьему сывороточному альбумину, овальбумину, овомукоиду, общему яичному протеину, глиадину, глю- тенину из пшеницы и изоляту белков сои и выявляют наличие oвaльбy п нa и бычьего сывороточного альбумина в грудном молоке и при наличии титра антител 1:40 и выше к белкам в сыворотке крови матери и ребенка, при наличии антител в титре 1:8 и вьш1е оваль- бумина и бычьего сывороточного альбумина в грудном молоке корректируют рацион питания кормящих матерей.