Способ получения исходного селекционного материала сахарной свеклы Советский патент 1989 года по МПК A01H1/04 

1

Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве.

Цель изобретения - снижение трудоемкости, расширение генофонда фертильной свеклы и повышение выхода особей на фертильной основе.

На фиг. 1 представлены схемы спектров митохондриальной ДНК корнеплодов сахарной свеклы фертильной линии ИМ; на фиг. 2 - схемы спектров в сравнении корнеплода сахарной свеклы опылителя О-типа БУО-1 и сахарной свеклы со стандартной цитоплазмой БУО N-2.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут корнеплоды исходной популяции фертильной сахарной свеклы. Количество корнеплодов в пробе для отбора одного источника новой цитоплазмы в зависимости от исходной популяции может составлять до 150 шт. В каждом корнеплоде определяют

особенности генов цитоплазмы. Для определения этих особенностей используют метод рестриктного анализа митохондриальной ДНК, причем из гомогенизированных тканей корнеплодов сахарной свеклы выделяют ДНК митохондрий, которую гидролизуют с помощью фермента, подвергают электрофорезу, гель-электрофорез фотографируют в ультрафиолетовом свете. Полученные рестриктные спектры ДНК сравнивают со стан дартным спектром исходной популяции. На основании такого сравнения отбирают корнеплоды с мутацией цитоплазмы, которые идентифицируют между собой.

Для повыщения выхода корнеплодов- мутантов, отличающихся по цитоплазме, отбор их ведут среди опылителей О-типа.

Положительный эффект предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет расширить генофонд и направленно вовлечь в селекционный процесс растения с разной цитоплазмой для создания линий и гибридов

05

со

фертильной сахарной свеклы с новыми свой- ciaaMH, определяемыми генетическими раз- лр1чиями цитоплазмы.

I Отбор мутантов среди опылителей О-типа дает возможность повысить вероятност встречи с растениями, отличающимися цитоплазмой, и, следовательно, сократить /в пределах до 150 раз) затраты времени, труда и средств на отбор каждого источника новой цитоплазмы по сравнению с отбором его из оэычной популяции культуры свеклы.

Пример. В качестве исходных популяций с;1харной свеклы взяли фертильные линии - Ивановская многосемянная (ИМ) и сорт Белоцерковская односемянная (БЦО). Кро- мЬ того, испытанию подвергли корнеплоды сахарной свеклы - опылителей О-типа (за- к|)епителей стерильности), сорта Белоцер- к|)вская односемянная (БЦО), линий Ива- н|)вская односемянная (ИО 117, ИО 194, 3X4 ГЦ 83), Ялтушковская односемян- н|1я (ЯО 4128, ЯО 4130) и др.

I В указанных корнеплодах фертильной сахарной свеклы определили биохимические оаобенности генов цитоплазмы, для чего ис|пользовали рестриктный метод анализа м||1тохондриальной ДНК- Ткани корнеплодов (|о 50 г) гомогенизировали в буфере (А), содержащем 50 мМ трис; 3 мМ ЭДТА; 330 мМ сорбита; 0,1% В А; 0,01 мМ меркап- тоэтанола; рН 8,0.

; Затем выделили из го.могенизированных тЦаней корнеплодов митохондрии. Массу О11жали через фильтр. Гомогенат центрифугировали при 3200 об/мин и температуре

0;С в течение 10 мин. Супернатант понторно центрифугировали при 10000 об/мин и тем- пфатуре 0°С в течение 15 мин.

Осадок митохондрий суспендировали в 10 мл буфера (А). Митохондрии обработали ДИКазой для удаления примесей ядерной и Хлоропластной ДНК. К суспендированному ос1адку добавили 10 мМ MgCb и 250 мкг ДНКазы. Гидролиз провели при температуре в течение 30 мин.

Действие фермента прекратили путем добавления 3-кратного объе.ма буфера (Б), содержащего 25 .мМ ЭДТА; 0,6 мМ сахарозы 50 мМ трис - НС1; рН 8,0.

После этого митохондрии осадили путем центрифугирования при 10000 об/мин в те- че ние 15 мин. Осадок митохондрий суспендировали в 10 мл буфера (Б).

Затем суспендированный осадок наслоили на ступенчатый градиент сахарозы: 45, 36 и 30%-ной сахарозы соответственно по 5, 10 и 10 мл.

Градиент сахарозы с наслоенным осадком митохондрий центрифугировали при 2СЮОО об/мин и температуре 4°С в течение

1ч. Очищенные митохондрии собрали в слое между 45 и 36%-ной сахарозой.

ДНК из очищенных митохондрий выделили следующим образом. В митохондрии

добавили 1 мл раствора .проназы концентрацией 6 мг/мл и суспендировали их. Затем добавили 1,2 мл 10%-него раствора лаурил- саркозилата натрия, перемешивая, довели объем смеси до 6 мл буфером, содержащим 50 мМ трис, 20 мМ ЭДТА, рН 8,0. Инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 1 ч. В полученный лизат влили 2 мл 4 М хлористого цезия. После этого ли- зат центрифугировали при 2000 об/мин в течение 30 мин.

К надосадочной жидкости добавили 3,2 г

сухого хлористого цезия, 100 мкл раствора

бромистого этидия концентрацией 10 мг/мл

и подслоили 3 мл 6 М раствора хлористого

5 цезия.

Градиент центрифугировали при 25000 об/мин в течение 12 ч.

Слой митохондрий отобрали в ультрафиолетовом свете, развели в три раза водой и центрифугировали при 35000 об/мин в те- чение 3 ч.

Полученный осадок ДНК растворили в 100 мкл воды, добавили к раствору 2-кратный объем этанола и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 1 мин. 5 Осадок ДНК промыли 2 раза 70%-ным этанолом, выгушили и растворили в 100 мкл воды.

Гидролиз ДНК провели с помощью фермента Ват HI в 50 мкл реакционной среды,

0 содержащей 10 мМ трис НС, рН 7,6; 60 мМ NaCl; 10 мМ 1 мМ меркаптоэтанола и 2 мкг митохондриальной ДНК.

После инкубации длительностью 3 ч при температуре 37°С фрагменты подвергли электрофорезу в 0,8%;-ном агарозном геле

5 в течение 16 ч.

Гель-электрофорез ДНК митохондрий

фотографировали в ультрафиолетовом свете.

Таким образом, получили рестриктный

спектр митохондриальной ДНК по каждому

Q корнеплоду отобранных для исследования растений сахарной свеклы.

Рестриктные спектры митохондриальной ДНК корнеплодов опылителей О-типа сравнили с тождественными между собой спектрами стандартной цитоплазмы исходных

5 популяций, из которых получен тот или иной опылитель. В результате сравнения установили, что сорт БЦО со стандартной цитоплазмой отличается от всех других изученных популяций фертильной сахарной свеклы, стандартная цитоплазма которых выще,

0 тождественна.

На основании сравнения установили закономерность, которая находит выражение в том, что каждый опылитель О-типа является мутантом по цитоплазме в отнощенин к исходной популяции, на основе которой

- он создан.

Как видно из материалов, представленных на фиг. 2, спектр митохондриальной ДНК опылителя О-типа БЦО (фиг. 2.1) отличается от спектра цитоплазмы исходной популяции (фиг. 2.2) наличием в нем фраг- метов ДНК - 1-7, 13, отсутствующих в смежном (контрольном) спектре, который, с другой стороны, имеет свои отличительные фрагменты ДНК - 1-5, 7, 12, 14.

По сравнению с отбором фертильных растений-мутантов из исходных популяций сахарной свеклы по известному способу выход источников новой цитоплазмы увеличивается многократно, поскольку каждый опылитель О-типа является мутантом по цитоплазме в отношении популяции, на основе которой он создан.

Предлагаемый способ позволяет выявлять, отбирать и идентифицировать на генетической основе фертильные растения сахар0

5

ной свеклы как среди ее популяций, так и среди опылителей О-типа.

Формула изобретения

1.Способ получения исходного селекционного материала сахарной свеклы, включающий отбор из популяции растений с модифицированной цитоплазмой, отличающийся тем, что, с целью снижения трудоемкости, расширения генофонда фертильной свеклы и выхода особей на фертильной основе, отбор растений с модифицированной цитоплазмой ведут среди закрепителей стерильности ЦМС-форм.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что модификацию цитоплазмы определяют методом рестриктного анализа митохондриаль- ной ДНК корнеплодов.

Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано в сельском хозяйстве. Цель изобретения - снижение трудоемкости, расширение генофонда фертильной свеклы и повышение выхода особей на фертильной основе. Из гомогенизированных тканей корнеплодов сахарной свеклы выделяют ДНК митохондрий, которую гид- ролизуют с помощью фермента и подвергают электрофорезу. Полученные рестриктные спектры ДНК сравнивают со стандартным спектром исходной популяции. На основании сравнения отбирают корнеплоды с мутацией цитоплазмы. Для анализа выделяют ДНК из закрепителей стерильности ЦМС-форм. 1 3. п. ф-лы, 2 ил. § (Л

CZI3

czD ci:

2

3

J2 -75

.16 -17

J3 -20

23

г4

.28 28

фиг.1

QnCrj

/2

ф1/г.2