Способ анализа митохондриальной ДНК растений Советский патент 1992 года по МПК A01H1/04 

Изобретение относится к генетико-се- лекционным исследованиям, а также исследованиям по молекулярной генетике, молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано в работах по определению типа растительной цитоплазмы, имеющих важное значение при генетическом анализе материала, полученного путем обычной и соматической гибридизации и методами химического мутагенеза, генетической и клеточной инженерии. Предлагаемое изобретение может быть использовано также при подборе родительских пар для получения гибридных семян сельскохозяйственных культур, имеющих пищевую и кормовую ценность.

Известен способ анализа митохондри- альной ДНК растений, включающий выделе- ние митохондрий из семидневных этиолированных проростков растений, лизис органелл и фракционирование митохон- дриальной ДНК путем равновесного ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием. Полученная ультрацентрифугированием

митохондриальная ДНК после освобождения от бромистого этидия, депротеиниза- ции хлороформом, диализа подвергается анализу методом электрофореза.

Недостатком этого способа является наличие трудоемких и длительных стадий, при проведении которых возможна потеря отдельных фракций мтДНК или их денатурация. Способ может быть осуществлен в целом за 14 суток, Кроме того, способ не позволяет осуществлять массовый анализ митохондриальной ДНК.

Известен способ анализа митохондриальной ДНК растений, основанный на получении очищенных от примесей митохондрий, их лизисе с последующей очисткой ДНК путем ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия, депротеини- зации хлороформом, диализа. Полученный препарат ДНК анализируют посредством электрофореза в геле агарозы. Способ при своем проведении занимает в среднем 6 суток. Недостатком такого способа является существование трудоемких и длительных стадий, при осуществлении которых возю

С

vi ел ю

GJ СО 4

можна потеря отдельных фракций митохон- дриальной ДНК (например, плазмидопо- добных ДНК) или их денатурация. Другим недостатком является невозможность проведения одновременного массового анализа ДНК митохондрий разных растительных генотипов.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ анализа митохондриальной ДНК, включающий получение очищенных от при- месей митохондрий, их лизис с последующей очисткой ДНК путем трехкратной фенол-хлороформной экстракции и осаждения этанолом. Полученный препарат ДНК анализируют методом электрофореза в геле агарозы. Проведение данного способа занимает, в среднем, 6 суток. Недостатком способа является то, что при реализации данного способа возможны потеря отдельных фракций митохондриальной ДНК (на- пример, плазмидоподобных ДНК) или их денатурация. Кроме того, способ не позволяет одновременно проводить массовый анализ ДНК митохондрий разных генотипов растений.

Цель изобретения -упрощение способа и повышение массовости анализов митохондриальной ДНК в генетико-селекцион- ных исследованиях. Способ основан на лизисе изолированных растительных мито- хондрий с помощью детергента в геле агарозы. Оптимальные условия лизиса в геле агарозы создаются благодаря использованию анионного детергента додецилсульфа- та натрия. Элекгрофоретический анализ в геле агарозы полученного таким способом препарата митохондриальной ДНК позволяет индентифицировать тип цитоплазмы (фертильный или стерильный), выявить конкретный тип стерильности (Т-, S- или С- в случае кукурузы), определить видоспецифи- ческий набор митохондриальной ДНК разных размерных классов (необходимо при анализе типа цитоплазмы у потомства при межвидовых скрещиваниях или при знали- зе цитоплазмы у аллоплазматических форм растений). Предлагаемый способ позволяет сократить время проведения процедуры анализа в среднем в 1,5-2 раза. Одновременно создается возможность проведения массовых анализов митохондриальной ДНК у нескольких генотипов.

Известные способы анализа митохондриальной ДНК растений основаны на использовании полностью очищенного препарата ДН К митохондрий и требуют проведения трудоемких и длительных стадий ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия с этидийбромидом и фенолхлороформной экстракции. При анализе ДНК митохондрий вышеуказанными способами невозможно упростить процедуру анализа и предотвратить возможную потерю отдельных размерных классов ДНК орга- нелл (например, плазмидоподобных ДНК). При этом отсутствует возможность одновременного анализа ДНК митохондрий нескольких генотипов, что является необходимым условием сравнительного анализа в генетико-селекционных исследованиях. В отличие от этого анализ митохондриальной ДНК растений в предлагаемом техническом решении проводится путем ли- зирования митохондрий в геле агароэы с помощью детергента и электрофореза освобождаемых нуклеиновых кислот, что значительно упрощает процедуру и ускоряет (по меньшей мере, в 1,5-2 раза) время ее проведения. Одновременно создается возможность массового проведения анализа митохондопальной ДНК у нескольких генотипов сразу (максимальное число анализируемых генотипов-12).

Предложенный способ отличается от прототипа использованием процедуры лизиса митохондрий с помощью анионного детергента непосредственно в ячейке блока агарозного геля.

П р и м е р 1. Семена гибридов кукурузы Жеребковский-86МВ и Красноцарский- 362ТВ проращиваются в термостате при 27°С в темнотена влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили трехдневных этиолированных проростков этих гибридов в количестве 5 г срезаются и используются для выделения митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Для этого срезанные побеги кукурузы помещают в предварительно охлажденный стакан гомогенизатора, заливаются ледяной средой выделения (соотношение навески побегов и среды 1:4) и быстро измельчаются ножницами. Растительная ткань с помощью пресса продавливается через небольшие отверстия в поршне гомогенизатора (диаметр отверстий 0,5 мм). Среда выделения содержит сахарозу (0,3 М), КН2Р04 (0,018 М, рН 7,2), ЭДТА (0,005 М), KCI (0,010 М), MgCI2 (0,001 М), меркаптоэтанол (0,010 М).

Гомогенат фильтруется через капроновую ткань и центрифугируется при 2000д в течение 3 мин. Осадок отбрасывается, над- осадочная жидкость центрифугируется 3 мин при 2000д. Полученный осадок митохондрий тщательно промывается в 4 мл среды выделения, из состава которой исключен меркаптоэтанол (среда промывания). Время промывания составляет 3 мин. Среда промывания содержит дополнительно бычий

сывороточный альбумин (10 мг/мл). Промытые митохондрии осаждаются центрифугированием при 2000д в течение 3 мин. Митохондриальный осадок ресуспендиру- ется в 0,3 мл буфера, содержащего 0,030 М трис-HCI (рН 8,0), 0,005 М ЭДТА, 0,1 М NaCI, 20%-ную сахарозу. Ячейки вертикального блока 0,8% агарозного геля (размер геля 110x90x2 мм) наполняются лизирующим буфером, содержащим 2%-ный додеци л сульфат натрия, 5%-ную сахарозу, 0,05%-ный бромфеноловый синий в трис-боратном буфере (рН 8,3) по 20 мкл в каждую ячейку. Состав трис-боратного буфера: трис (0,089 М), борная кислота (0,089 М), ЭДТА (0,0025 М), Подлизирующий буфер наслаивается по 10 мкл суспензии митохондрий. Электрофорез в стандартном приборе с платиновыми электродами проводится в трис-боратном буфере в течение 1 ч при напряжении 1 В/см, затем втечение2,5ч при напряжении 5 В/см. Гель окрашивается в растворе бромистого этидия в воде (0,5 мкг/мл) и фотографируется в ультрафиолетовом свете. На электрофореграмме (фиг.1) выявляется ДНК митохондрий из 0,3 г проростков кукурузы. Анализ на электрофореграмме фракций ми- тохондриальной ДНК, принадлежащих гибридам Жеребковский-8бМВ и Краснодарский-362ТВ, показывает, что первый гибрид получен на основе цитоплазма- тической мужской стерильности (ЦМС) молдавского типа (S-тип цитоплазмы), в второй гибрид на основе ЦМС техасского типа (Т-тип цитоплазмы). Для S-типа цитоплазмы, как показано в прототипе, характерно наличие двух линейных плазмидоподобных ДНК S1 и S2 размером, соответственно, 6,397 т.п.н,, 5,452 т.п.н., которые обнаруживаются на электрофореграмме (фиг.1,Б). Для цитоплазмы Т-типа характерно присутствие другого набора плазмидоподобных ДНК (ппДНК): линейной ДНК размером 2,1 т.п.н. и кольцевой 1,95 т.п.н., которые также отчетливо видны на фотографии (фиг.1,А). Таким образом, данный способ позволяет проводить анализ митохондриальной ДНК конкретного генотипа и установить на основе какого типа ЦМС был получен исследуемый гибрид.

П р и м е р 2-. Семена гибрида кукурузы Краснодарский-ЗОЗТВ проращиваются в термостате при 27°С в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили 3-4- дневных этиолированных проростков гибрида в количестве 10 г срезаются и используются для выделения митохондрий методом дифференциального центрифугирования. Процедура выделения митохондрий и дальнейшие этапы анализа мтДНК

аналогичны описанным в примере 1. В отдельном варианте при внесении митохондриальной суспензии в ячейку геля добавляли проназу из расчета 5 мг/мл. Ре- зультаты электрофоретического анализа мтДНК гибрида кукурузы Краснодарский- ЗОЗТВ приведены на фиг.2 (1 - контроль; 2

-обработка проназой; 3 - контроль). Из данных фиг.2 следует, что способ позволяет

0 определить присутствие высокомолекулярной мтДНК и фракций плазмидоподобной ДНК (лпДНК). Обработка проназой приводила к увеличению электрофоретической подвижности фракции ппДНК, что позволя5 ет предполагать существование подвижных комплексов вида ДНК с белками. В варианте с обработкой проназой отмечено лучшее проявление полос ппДНК на электрофореграмме. Соответствие полос на электрофо0 реграмме фракциям ДНК и РНК установлено путем обработки наносимого препарата ДНКазой и РНКазой, соответственно (данные не приводятся). Возможность включения в процедуру анализа

5 мтдНК ферментативных обработок (ДНКазой, РНКазой, проназой) является дополнительным преимуществом предлагаемого метода.

П р и м е р 3. Семена кукурузы гибридов

0 Жеребковский-86МВ и Краснодарский- 362ТВ проращиваются в термостате при 27°С в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили 3-дневных этиолированных проростков гибридов в количестве

5 10 г срезаются и используются для выделения митохондрий, как описано в примере 1. Лизис изолированных органелл и электро- форетический анализ мтДНК гибридов проводится в блоке горизонтального

0 агарозного геля. Результаты анализа мтДНК гибридов Жеребковский-86М (А) и Красно- дарский-362ТВ (Б) представлены на фиг.З (В

-Hind II - фрагменты ДНК фага Я, используемые в качестве электрофоретических

5 маркеров). Из данных фиг.З следует, что препарат мтДНК гибрида Жеребков- скийЗбМВ в отличие от Краснодарского 362ТВ, содержит линейные S1 и S2 ппДНК размером 6,4 и 5,4 тысяч пар нуклеотидов

0 соответственно.

П р и м е р 4. Семена кукурузы линии Оп56А и гибридов 155хС103и 9хС103 проращиваются в термостате при 27°С в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Коле5 оптилиЗ-дневныхэтиолированныхпроростков линии и гибридов в количестве 20 г срезаются и используются для выделения митохондрий, как описано в примере 1. Осадок изолированных митохондрий ресуспен- дируется в 500 мкл буфера, содержащего

0,030 М и трис-HCI (рН 8,0), 0,005 ЭДТА, 0,1 М NaCI, 20%-ную сахарозу. Результаты электрофоретического анализа мтДНК линии Oh 56A и гибридов W155xC103 и WF9xC103 в блоке вертикального агарозно- го геля представлены на фиг.4. Можно видеть, что отдельные фракции мтДНК линии и гибридов выявляются в виде четких хорошо разрешающихся на электрофореграмме полос.

П р и м е р 5. Семена кукурузы линии Оп56Аигибридов Л/155хС103и Л/Р9хС103 проращиваются в термостате при в темноте на влажной фильтровальной бумаге. Колеоптили 3-дневных этиолированных проростков линии и гибридов в количестве 20 г срезаются и используются для выделения митохондрий, как описано в примере 1. Осадок изолированных митохондрий ресус- пендируется в 500 мкл буфера, содержащего 0,030 М трис-HCI (рН 8,0), 0,005 М ЭДТА, 0,1 М NaCI, 0,1 М NaCI, 20%-ную сахарозу. При нанесении препарата для анализа используют разные количества митохондри- альной суспензии: 5,10,20 мкл суспензии органелл. Результаты анализа мтДНКлинии и гибридов приведены на фиг.4 (А,Б,В - 10, 20 и 5 мкл митохондриальной суспензии соответственно). Можно видеть, что наиболее оптимальным объемом митохондриальной суспензии (при ресуспендировании митохондрий, полученных из 20 г проростков, в 500 мкл) для анализа фракций мтДНК методом лизиса органелл в ячейке вертикального агарозного геля является 5 мкл. При этом наблюдаются наиболее четко разрешающиеся полосы ДНК.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ анализа митохондриальной ДНК растений, основанный на лизисе митохондрий с помощью анионного детергента додецилсульфата натрия в ячейке вертикального или горизонтального агарозного геля и разделения освобождающихся нуклеиновых кислот с помощью электрофореза, выгодно отличается от ранее известных способов анализа митохондриальной ДНК вышеописанных аналогов и прототипа. При этом удается избежать использования дорогостоящих импортных реактивов и импортного оборудования (ультрацентрифуги, пробирки), а также денатурации и потерь анализируемых фракций митохондриальных ДНК.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в следующем: высокая нативность препарата митохондриальной ДНК анализируемого генотипа, достигаемая за счет быстроты реализации предлагаемого способа; сокращение времени проведения

процедуры анализа в среднем в 1,5-2 раза; отсутствие дорогостоящих процедур очистки митохондриальной ДНК (ультрацентрифугирование в градиенте хлористого цезия с этидийбромидом, хроматография на сефарозных гелях с использованием импортного оборудования и реактивов); возможность проведения массовых анализов митохондриальной ДНК у нескольких генотипов (максимальноевозможноечисло

анализируемых генотипов-12); возможность введения в процедуру анализа митохондриальной ДНК ферментативных обработок.

Электрофоретический анализ в геле ага- розы полученного предлагаемым способом

препарата ДНК митохондрий позволяет установить следующее: в случае потомства межвидовых скрещиваний, полученного методом соматической гибридизации, определить по видоспецифическому набору

митохондриальных ДНК разных размерных классов, какому из родителей принадлежит цитоплазма; идентифицировать тип цитоплазмы растения (фертильный или стерильный); в случае стерильных растений

установить конкретный тип цитоплазмати- ческой мужской стерильности (например Молдавский, Техасский или С-тип для кукурузы).

Формула изобретения

1.Способ анализа митохондриальной ДНК растений, включающий выделение митохондрий из этиолированных проростков растений, лизис митохондрий в присутствии

детергента и буфера с последующий фракционированием митохондриальной ДНК методом электрофореза в агарозном геле, о т- личающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения точности анализа,

лизис митохондрий проводят в электрофо- ретической ячейке во время префореза, при этом в качестве детергента используют до- децилсульфат натрия, а в качестве буфера - раствор, содержащий трис в концентрации

0,089 моль, борную кислоту в концентрации 0,089 М и ЭДТА в концентрации 0,0025 М.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что лизис митохондрий проводят в течение 60 мин при напряжении 1 В/см,

Использование: генетико-селекцион- ные исследования, молекулярная генетика. Сущность изобретения: очищенный препарат митохондрий, выделенных из этиолированных проростков, лизируют с помощью додецилсульфата натрия в электрофорети- ческой ячейке блока агарозного геля в течение 1 ч при напряжении 1 В/см, после чего проводят электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот. 1 з.п. ф-лы, 4 ил.

Б А В

©

Й/г.2

0

©

хр.тДНК

пп нтДНК