Способ раннего прогнозирования гетерезиса по хозяйственным признакам у гибридов тутового шелкопряда Советский патент 1989 года по МПК A01K67/04 

Изобретение относится к биохимии и селекции хозяйственно ценного вида насекомых - тутового шелкопряда.

Цель изобретения - повышение достоверности и сокращение времени прогнозирования.

Способ осуш,ествляют следуюш,им образом.

Навеску грены (0,2 г) гомогенизируют в ступках при 0°С и белки- экстрагируют 2 мл 0,15 М раствора хлорида натрия в течение 15 мин. Экстракт центрифугируют при 180ПО g в течение 20 мин. В полученном супернатанте определяют концентрацию белка по методу Бредфорд и исследуют его для определения активности ферментов. Активность кислой фосфатазы определяют спектрофотометрически, в качестве субстрата используют /г-нитрофенилфосфат. Для определения активности к 0,1 мл белкового экстракта добавляют 1,5 мл субстрата, растворенного в 1,4 мл 0,05 М ацетатного буфера, рН 4,6. Смесь инкубируют при 37°С в течение 20 мин. Реакцию останавливают добавлением 2 мл 0,2 М раствора NaOH. В контроль белковый экстракт вносят после добавления щелочи. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при 405 нм. За единицу активности фермента принимают гакое его количество, которое катализирует высвобождение 1 мк.моль п-нитрофенола за 1 мин. Количество выделившегося нитрофенола определяют по калибровочной кривой.

;

О5 00 4:: СХ) Oi

Удельную активность рассчитывают в единицах активности на 1 мг белка.

Активность глюкозо-6-фосфатдегидроге- назы определяют непосредственно в кювете спектрофотометра, внося в нее реакционную смесь в следующем составе: 1 мл глицин- NaOH буферного раствора (рЯ 9,5), содержащего 6 мМ р-меркаптоэтанола; 1 мл 3 мМ раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты; 1,8 мг глюкозо-6-фосфата в 0,1 мл дистиллированной воды; 1,8 мг НАДФ в О, мл дистиллированной воды и 0,1 мл экстракта грены. Экстракт предварительно разбавляют в 3 раза дистиллированной водой. Величину поглощения НАДФН измеряют в течение 5 мин при 340 нм; Активность рассчи- ть(вают по формуле

/6,22

Рде/1. - прирост поглощения при 340 нм;

активность фермента (в единицах

активности); V - объем пробы, мл; ; - время инкубации, мин; 6,22 - коэффициент пересчета.

За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое катализирует образование 2 мкмоль НАДФН в 1 м ин Удельную активность рассчитывают 3 единицах активности на 1 -кг белка. Активность кислой ДНКазы определяют спектро- фотометрически, используя в качестве субстрата предварительно денатурированную нагреванием (100°С, 10 мин) высокомолекулярную ДНК. Инкубационная смесь для определения активности ДНКазы содержит 0,1 мл 0,2%-ного водного, раствора субстрата- 0,2 мл 0,5 М ацетатного буфера (рН 5,2); О { мл 0,01 М раствора М С/2; 0,4 мл дистиллированной воды и 0,2 мл белкового экстракта. После инкубации в течение J ч при 37°С смесь охлаждают в ледя1-:ой бане, добавляют 2 мл 0,5 М раствора ллорной кислоты и выдерживают при ОЧ: в течение 20 мин. Осадок отделяют центрифугирова- 1:ием при 6000 g в течение 10 мин и измеряют оптическую плотность супернатанта при 260 мм против контрольной пробы, в рую фермент добавляют после инкубации. За единицу активности фермента принимают такое его количество, которое вызывает увеличение оптической плотности на 1 единицу за 1 ч. Удельную активность рассчитывают в единицах активности на 1 кг белка.

Прирост или убыль удельной активности каждого из исследованных ферментов в грене гибрида по отношению к таковой в грене родительских пород рассчитывают по формуле

5 ip -lXlOO,

1

где S - прирост или убыль ферментативной активности (в процентах);

/ - удельная активность фермента у

гибрида;

Л i -среднее значение активности фермента у родительских пород.

Если активность всех трех исследованных

ферментов в грене гибридов превосходит среднее арифметическое значение активности ферментов в грене родительских пород, делают заключение о целесообразности выращивания данного гибрида, у которого сле- дует ожидать гетерозис по ряду показате лей (среднему весу коконов, весу шелковой оболочки). Сопоставляют результаты определения удельной активности ферментов в грене пород и гибридов тутового щелкопря5 да (табл. 1). В грене гибрида ПС5 ул х СК2 наблюдается прирост удельной активности исследованных ферментов по сравнению со среднеродительским показателем: значения для активности кислой фосфатазы, кислой

ДНКазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 0 сост.г5ляют у данного гибрида +61,1 +63,3 и +38,3% соответственно. Гибрид ПС5 ул х СК2 является перспективным. В грене гибрида СК2 X САНИИШ 30 наблюдается снижение удельной активности по сравнению со 5 среднеродительским показателем: значения для активности кислой фосфаТазы, кислой ДНКазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы составляют у гибрида -38,8%-- 50,4%. -28,7% соответственно. Гибрид СК2 X САНИИШ 30 следует признать не- 0 перспективным для выращивания.

В результате контрольных выкормок данных гибридов было установлено, что гибрид ПС5 ул X СК2 проявляет гетерозис по среднему весу коконов и весу щелковой обо5 лочки (на 0,4% и 7,1% соответственно), а гибрид СК2 X САНИИШ 30 не обладает гетерозисными свойствами по данным показателям (табл. 2).

Результаты определения удельной активности кислой фосфатазы, кислой ДИКазы и

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в грене пород и гибридов тутового щелкопряда представлены в табл. 1.

Средний вес кокона и вес шелковой оболочки у пород и |-ибридов представлены

в табл. 2.

Предлагаемый способ, основанный на точном количественном определении активности ферментов, позволяет в короткое время (в течение 1 рабочего дня проанализиро50 вать большое количество (несколько десятков) образцов грены. Данный способ более экономичен, поскольку не требует дополнительного оборудования (приборов для проведения электрофореза и сканирования энзи- мограмм), открывает возмож-ность быстрого

55 массового определения удельной активности в большом количестве образцов грены тутового щелкопряда с целью раннего (на стадии яйца) прогнозирования гетерозиса у

тутового шелкопряда, что позволяет избежать дорогостоящих выкормок, необходимых для сопоставления показателей продуктивности у пород и гибридов насекомых.

Формула изобретения

Способ раннего прогнширования гетерозиса по хозяйственным признакам у гибридов тутового шелкопряда, включаюш,ий определение активности ферментов кислой фос- фатазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в белковых экстрактах грены пород и гибридов тутового шелкопряда и суждение о гетерозисе выращиваемых гибридов, отличаю

щийся тем, что, с целью повышения достоверности и сокращения времени прогнозирования, проводят определение удельной активности перечисленных ферментов и дополнительно кислой ДНКазы спектрофото- метрическим методом, сравнивают значение удельной активности всех трех ферментов в грене тестируемых гибридов CQ среднеарифметическим значением удельной активности соответствующих ферментов в грене родительских пород и в случае повыщенной удельной активности грены гибридов в сравнении с греной родительских пород делают заключение о наличии гетерозиса у тестируемых гибридов.

Таблица 1

Изобретение относится к биохимии и селекции хозяйственно ценного вида насекомых - тутового шелкопряда. Цель изобретения - повышение достоверности и сокращение времени прогнозирования. Проводят определение удельной активности ферментов кислой фосфатазы, глюкозо-6-фосфатдегид- рогеназы и кислой ДНКазы в белковых экстрактах грены пород и гибридов тутового шекопряда спектрофотометрическим методом, сравнивают значение удельной активности всех трех ферментов в грене тестируемых гибридов со среднеарифметическим значением удельной активности соответствующих ферментов в грене родительских пород и в случае повышенной удельной активности грены гибридов в сравнении с греной родительских пород делают заключение о наличии гетерозиса у тестируемых гибридов. 2 табл. (Л

Примечание, S- превосходство гибрида по сравнению со среднеродительским показателем у исходных пород по уровню ферментативной активности.

Таблица