Способ идентификации породы тутового шелкопряда Советский патент 1985 года по МПК A01K67/04 

эо

9)

QO

Изобретение относится к биохимии и селекции хозяйственно-ценного вида насекомых - тутового шелкопряда и может быть использовано для определения породы, а также гибридов тутового шелкопряда на фазе яйца.

Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени идентификации породы тутового шелкопряда,

а также снижение трудоемкости способа.

Предложенный способ осуществляется следующим образом.

Для вьщеления растворимых белков навеску грены (100 мг) заливают 1 нп 0,15 М раствора хлорида натрия и растирают в фарфоровой ступке при ОС в течение 15 мин. Полученный экстракт- центрифугируют при 19 000g в течение 30 мин, осадок отбрасывают, а супернатант фильтруют через двойной слой капроновой ткани, определяют в нем концентраций белка-и используют для дальнейшей работы. Фракционирование белков осуществляют методом изоэлектрофокусирования В тонком слое полиакриламидного геля в диапазоне рН 4,0-6,5. Для получения спектра растворимых белков достаточно 200 мкг белка из одного образца грены. По окончании изоэлек.трофокусирования гелевые пластины фиксируют в смеси, состоящей из 150 мл этилового спирта и 350 мл дистиллированной воды с растворенными в ней 17,5 сульфосалициловой кислоты и 57,5 г трихлоруксусной кислоты. Фракцию проводят в течение 45 мин, после чего белки на пластине окрашивают 0,1%-ным раствором кумаси R-250, который готовят на смеси: этанол - уксусная кислота - вода (в соотношении 3:1:8). Окрашивание ведут при 60°С в течение 15 мин. После окрашивания избыток красителя отмывают смесью этанола, уксусной кислоты и воды (3:1:8) в течение 18 ч. Отмытую пластину заливают на 1,5 ч предохраняющим раствором, содержащим глицерин и отмывочную смесь в соотношении 1:10, и далее высушивают при комнатной температуре в течение 14 ч.

Полученная таким образом электрофореграмма может храниться при комнатной температуре по крайней мере в течение 1 года.

. Электрофореграмму растворимых белков идентифицируемой породы сопоставляют с эталонной электрофореграммой. Эталоном является суммарньм белковый спектр всех белковы зон, выявленных у различных пород тутового, шелкопряда методом изоэлектрофокусирования .

Для составления формул растворимых белков грены белковые фракции, выявленные на электрофореграмме, обозначают соответствующими номерами: 1-й номер - у белковой зоны с наивысшей изоэлектрической точкой (р1), а последний (24-й)номер - у белковой зоны с наименьшей величиной р1. Степень выраженности белковых зон обозначают черточкой под номером (интенсивная зона) или над номером (слабая зона). Очень слабые зоны обозначают двумя черточками над номером, а двойные зоны - двумя точками. Каждая порода тутового шелкопряда характеризуется неповторимым белковым спектром и соответствующей формулой.

На протеинограммах выявлены характерные белковые спектры двух пород. По эталонному спектру находим, что этим неизвестньш породам соответствуют белковые формулы: 1, 2, 3

.4,-, -, 7, S, 9, 10, -, -, ГЗ, 14, -, 16, .Г7, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и 1, -, З, 4, -, -, 7, 8, -, -, -, -, Гз, 14, -, Гб, Г7, -, 19, 20, , 22, 23,

Полученные белковые формулы сопоставляют с белковьпуш формулами известных пород тутовогЬ шелкопряда и делают заключение о принадлежности исследуемой грены к породам Калхида и САНИИШ-113.

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОРОДЫ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА, включающий определение характеристик идентифицируемой породы на стадии яйца, сравнительньы анализ полученных характеристик с аналогичными характеристиками известных пород и оценку породной принадлежности, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и сокращения времени идентификации, а также снижения трудоемкости, в качестве определяемой характеристики используют белковые формулы, полученные путем сравнения белкового спектра эталона с белковым спектром идентифицируемой породы, при этом белки разделяют по изоэлектрическим точкам, а эталоном служит суммарный белковый спектр всех белковых зон, выявленных у известных пород тутового шелкопряда методом изозлектрофокусирования, причем S оценку породной принадлежности осу(Л ществляют по совпадению белкового с спектра исследуемой породы с одним из белковых спектров известных пород.