Способ определения резистентности эритроцитов Советский патент 1989 года по МПК G01N33/49 

1

Изобретение относится к области медицины, в частности к гематологии, и именно к лабораторным способам выявления степени повреждения эритроцитов крови, и может быть использовано как в научно-исследовательской работе при изучении физико-химического состояния консервированных эритроцитов, так и клинической практике в качестве лабораторного метода,

позволяющего оценивать мембран эритроцитов при различной патологии системы крови, а также адекватность гемотрансфузиойной терапии.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа.

Способ осуществляется следугацим образом.

Берут 0,2-0,4 мл свежей крови, стабилизированной гепарином, либо цитратом натрия. К ней добавляют 20- 40 мл изотонического раствора хлористого натрия, перемешивают и затем центрифугируют при 3000g в течение 5 мин. Супернатант сливают, а к полученному осадку эритроцитов добавляют мл изотонического раствора NaCl (разведение в 100-150 раз) и делят суспензию эритроцитов на 2 равные части: 1 (контрольная проба) используется для получения полностью гемолизированных эритроцитов (100% гемолиз) путем добавления в суспензию 0,1 мл 2%-ного раствора тритона Х-100. Суспензия стоит 10±1 мин при комнатной температуре; 2 (опытная проба) - к суспензии эритроцитов добавляется 0,1 мл изотонического раствора хлористого натрия, чтобы разведение эритроцитов было, как в пробирке 1, и прогревают суспензию в течение 10±1 мин при 48т50 С. После температурной инкубации суспензию эритроцитов центрифуги1)уют 5 мин при 3000g и собирают супернатанты. Затем регистрируют величину оптической плотности супернатантов при длине волны 540 нм. Так как в пробирку № 1 был добавлен детергент тритон Х-100, вследствие чего все эритроцит гемолизировались, то величину оптической плотности, полученную для этого образца, можно принять соответствующей 100%-ному гемолизу. Исходя из этого, подсчитывают процент гемолиза при 48-50°С по формуле.

S-ie O- fJ-lQ

10 о %

Процент гемолиза

где D4j.5()°c величина оптической плот

ности опытной пробы; . величина оптической плот

ности контрольной пробы; После, этого судят о резистентнос- ти эритроцитов, причем при величине гемолиза 5-9% определяют умеренное снижение резистентности, а при величине гемолиза более 10% - вьфажент

to

15

ную степень снижения резистентности эритроцитов.

Проведенными экспериментами установлено, что степень гемолиза эритроцитов, полученных из крови здоровых доноров, при исследовании предлагаемым способом не -превышает 2-4%, а индивидуальные значения этого показателя колеблются от 0,2 до 4%.

Пример 1. В процессе диспансерного наблюдения за больным М., страдающим врожденной микросфероци- тарной анемией, проводили исследование степени повреждения эритроцитов крови. Дпя анализа брали 0,2 мл крови, стабилизированной цитратом натрия, к ним добавляли 20 мл изотонического раствора NaCl, содержимое 20 перемешивали и затем центрифугировали 5 мин при 3000g. Супернатант сливали, а к осадку эритроцитов добавляли 9 1-ш изотонического раствора NaCl (разведение в 100 раз), делили 25 Полученную суспензию на 2 части. К одной части добавляли О,1 мл 1%-ного раствора тритона Х-100 (100%-ньй гемолиз эритроцитов) и оставляли ее при комнатной температуре. К другой 30 части добавляли Oj1 мл изотаничес- кого раствора NaCl и помещали ее в термостат, где t 48 С. Выдерживали в течен ие 10 мин. Затем обе пробирки центрифугировали при 3000g в течение 5 мин. Супернатанты отбирали и на спектрофотомоторе регистрировали величину оптической плотности при длине волны 540 нм в пробирках 1 и 2 и по формуле определяли процент гемолиза. В данном случае исследование крови больного показало, что гемолиз эритроцитов составляет 27%, что указывало на выраженное снижение резистентности эритроцитов, а повторное исследование крови через два месяца после проведенного лечения показало, что гемолиз равен 5,2%, что указывало на увеличение, резистентности эритроцитов в крови больного и позволило считать пато- 50 логический процесс стабилизировавшимся. Исследование крови по прототипу показало лишь визуально, что в обоих случаях сыворотка крови приобрела красноватьм цвет, что свидетельствовало лишь о наличии гемолиза, но не оценивало количество его в сыворотке, т.е. не оценивало степень повреждения клеток.

35

40

45

55

51

Пример 2. Больной Б., страдает хронической гипопластической анемией с гемолитическим компонентом в течение 6 лет, У больного отмечаются выраженные посттрансфузионкые реакции гемолитического и негемолитического типа. Многократно при каждом поступлении в стационар определялась осмотическая резистивность эритроци- тоя, которая всегда оказывалась сниженной, независимо от клинического состояния больного, от активности трансфузионной терапии.

На фоне проводимого лечения - в первую очередь трнсфузий отмытых размороженных эритроцитов, у больного наступило ухудшение клинического состояния, связанное с посттрансфузионт ными реакциями, что было четко подтверждено исследованием; степени повреждения эритроцитов предлагаемым способом. Для анализа брали 0,2 мл крови, стабилизированной цитратом натрия, к ним добавляли 20 мл изотонического раствора NaCl, содержимое перемешивали и затем центрифугировали в течение 5 мин при 3000g. Супер- натант сливали, а к осадку эритроцитов добавляли 10 мл изотонического раствора NaCl (разведение в 150 раз) делили полученную суспензию на 2 части. К одной части добавляли 0,1 мл 2%-ного раствора тритона Х-100 и оставляли при комнатной температуре. К другой части добавляли 0,1 мл изотонического раствора NaCl и помещали ее термостат, где при t 50 С вьдерживали 11 мин, затем обе пробирки центрифугировали при SOOOg в течение 5 мин. Супернатанты исследовали при длине волны 540 нм и рассчи- тьтали процент гемолиза эритроцитов. Степень гемолиза эритроцитов до трансфузии составляла 5%, а после трансфузии - 13%, т.е. до трансфузии у больного наблюдалась умеренная сте- пе нь повреждения эритроцитов после трансфузии - степень повреждения стала выраженной. Стоит отметить, что эти показатели определены на фоне значительной билирубинемии и выраженного ретикулоцитоза, сохранявшихся на протяжении всего курса лечения.

Пример .3. Больной М., страдает врожденной микроцитарной гемолитической анемие. У больного постоянная билирубинемия, выраженньй peTHкулоцитоз на фоне вполне удовлетвори

0

5

0

5

9

0

5

0

5

5

4646

тельного общего состояния и отсутствия анемического синдрома. В процессе динамического дисперсного наблюдения за больным простое нетрудоемкое исследование резистентности эритроцитов дало следующие результаты: исследование, проведенное при поступлении, - 27% гемолиза, а исследование через 1,5 мес. - 9,0% гемолиза, что указьгаало на увеличение резистентности эритроцитов в крови больного и позволило считать патологический процесс стабилизировавшимся.

Предлагаемый способ позволяет быстро и точно оценить степень повреждения эритроцитов в крови больного и определить тактику лечения боль- 1НОГО. При исследовании крови гематологических больных предлагаемым способом (при соблюдении режима, указанного в формуле) наблюдалась умеренная или выраженная степень пов- режедния эритроцитов. Лишь в одном случае при железодефицитной анемии (заболевание, при котором мембрана эритроцитов обычно не повреждается) степень гемолиза эритроцитов бьша в пределах нормы (0,83%). В то же время исследование крови здоровых людей показало, что процент гемолиза эритроцитов не превышает 4% во всех случаях.

Таким образом, предлагаемьй способ надежен, прост в исполнении, на осуществление его достаточно 40 мин. По сравнению с прототипом для осуществления предлагаемого способа времени требуется в 10-15 раз меньше, количество образца взятого для анализа тоже сокращается примерно в 20 раз, кроме этого предлагаемый способ дает количественную оценку устойчивости эритроцитов.

Использование предлагаемого способа в гематологии обеспечит, прогнозирование развития тяжелых осложнений при забапеваниях крови. Способ также может быть использован при апробации новых лекарств и при научных исследованиях. Способ доступен любой научной и клинической лаборатории.

Способ позволяет определить тактику ведения больного (количество и вид трансфузионной терапии: эритро- цитарная масса, отмытые размороженные эритроциты), конкретизировать применение различных других лечебных

71469464

мероприятий. Результаты исследования, полученные данным способом, наряду с. другими показателями помогут врачу лучше оценить клиническое состояние больного, что немаловажно, например, для оценки трудоспособности бального, :Формула изобрет.е н .и я

8

хлористого натрия с последующим проведением нагревания одной части смет си 48-50 С в течение 10±1 мин и одновременной обработкой другой части смеси 1-2%-ным раствором тритона Х-100, затем полученные образщл центрифугируют, регистрируют их оптическую плотность при длине волны

Изобретение относится к медицине, точнее к гематологии, к лабораторным способам вьшвления степени повреждения эритроцитов крови, предназначено для изучения физик6-хими ческого состояния консервированных эритроцитов и для клинической прак- тики в лабораторных методах оценки состояния мембран эритроцитов при различной патологии системы крови. Цель изобретения - ускорение и повышение точ- точности способа. Для этого к пробе крови, стабилизированной гепарином иди цитратом натрия, добавляют изотонический р-р NaCl, центрифугируют при 3000g 5 мин. К отдельному осадку эритроцитов добавляют изотонический р-р NaCl (разведение в 100-150 /раз), делят суспензию на 2 равнее части, контрольную и опытную. Контрольная проба используется для получения гемо- лизированных эритроцитов (100% гемолиз) путем добавления в суспензию 2%-го р-ра тритона Х-100. Опытную пробу получают путем добавления к суспензии эритроцитов изотонического р-ра NaCl аналогично контрольной пробе, прогревают 5{н при 48-50 С. После температурной инкубации суспензию эритроцитов центрифугируют 5 мин при 3000g собирают супернатанты, регистрируют ну их оптической плотности при А 540 нм. Так как в пробирку с контролем добавлен детергент тритон Х-100, все эритроциты гемолизирова- лись и величину оптической плотности этого образца принимают соствет- |ствующей 100%-ному гемолизу (Д 100%). Исходя из этого, подсчитьшают % гемолиза при 48-50°С по формуле: % гемолиза (D48.)/D,oo A, где 4s-3o c величина оптической плотности опытной пробы; 100 - величина разведения проб. При величине гемолиза 5-9% определяют умеренное снижение резистентности, при гемолизе более 10% - выраженная степень снижения резистентности 3pnTpoipiTOB. «2

Способ определения резистентности о 540 им, рассчитывают процент гемоэритроцитов путем их нагревания, отличающийся тем, что с цепью ускорения и повышения точности способа, получают суспензию отмытых эритроцитов, разводят в 100-150 раз изотоническим раствором

лизировакных эритроцитов и при его величине 5-9% определяют умеренное снижение резистентности эритроцитов а при величине более 10% - выраженное снижение резистивности эритроцитов.