СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТАБИЛИЗАЦИИ С3-КОНВЕРТАЗЫ КЛАССИЧЕСКОГО ПУТИ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано для определения стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента человека.

Проблема оценки состояния иммунной системы организма человека остается в настоящее время актуальной в связи с тем, что многие соматические заболевания характеризуются иммунодефицитом, и соответствующая иммунокорригирующая терапия позволит более рационально и эффективно проводить терапию этих состояний.

Система комплемента является частью иммунной системы и состоит из более чем 30 компонентов, которые действуют каскадным механизмом. Эта система играет ключевую роль как в клиренсе ИК, так и в иммунном ответе на инфекционные агенты, чужеродные антигены, опухолевые и вирус-инфицированные клетки [Rittirsch D., Redl Н., and Huber-Lang М. Role of Complement in Multiorgan Failure // Clinical and Developmental Immunology. - 2012; 2012:962927. doi: 10.1155/2012/962927].

Известны три пути активации системы комплемента: классический, альтернативный и лектиновый, отличающиеся способом образования С3-конвертаз. Субстратом C3-конвертаз всех трех путей активации системы комплемента является компонент C3, при расщеплении которого образуются C3a и C3b. Присоединение дополнительных молекул C3b к C3-конвертазам приводит к образованию C5-конвертаз, которые запускают реакцию формирования мембрано-атакующего комплекса (МАК).

Классический путь является Ca²⁺/Mg²⁺-зависимым каскадом, который в норме запускается иммунными комплексами, активирующими C1, первый компонент комплемента, содержащий одну молекулу C1q и по две молекулы C1r и C1s. Активация C1 в результате связывания C1q-субкомпонента с Fc-фрагментом иммуноглобулинов иммунного комплекса и образования активных протеиназ C1r и C1s инициирует ферментативный каскад комплемента, приводящий к образованию C3-конвертазы классического пути (C4b, C2a) [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. М.: Мир, 2000. - 592 с].

Для исследования системы комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения исследуемой сыворотки добавляют к эритроцитам барана, сенсибилизированным антителами кролика (EA); 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. Активность комплемента выражают в гемолитических единицах. За одну гемолитическую единицу комплемента (CH₅₀) принимают такое его количество, которое вызывает гемолиз 50% стандартной суспензии EA. В сыворотке здоровых доноров обычно содержится 20-40 гемолитических единиц комплемента [Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник/ Меньшиков В.В., Делеторская Л.Н., Золотницкая Р.П. и др.: Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с].

Однако существенным недостатком этого метода является низкая информативность и, как следствие, отсутствие интереса со стороны практического здравоохранения в лабораторной диагностике.

Известен способ определения активности C3-конвертазы (C4b2a) классического пути активации системы комплемента, основанный на гемолизе сенсибилизированных эритроцитов барана (EA) с использованием 2 разных сывороток в качестве источников компонентов комплемента: C4b2a генерируется на EA с использованием компонентов C1, C4 и C2 из первой сыворотки с последующей второй реакцией, приводящей к гемолизу с участием компонентов C3-C9 из второй сыворотки в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУК) [Miller Е.С., Chase N.M., Densen P., et al. Autoantibody stabilization of the classical pathway C3 convertase leading to C3 deficiency and Neisserial sepsis: C4 nephritic factor revisited // Clinical Immunology. - 2012. - V.145. - P.241-250].

Недостатком этого способа является длительность, трудоемкость, недостаточная точность в связи с тем, что используются две разные сыворотки, гетерологичные антитела для сенсибилизации эритроцитов барана.

Техническим результатом предлагаемого способа является повышение чувствительности метода за счет исследования стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента человека, сокращение длительности процедуры исследования, упрощение, удешевление.

Указанный результат достигается тем, что лизис эритроцитов барана проводят 0,8% сывороткой крови человека с использованием эндогенных гетерофильных антител при температуре 37,0±0,5°C в течение 10 мин, добавляют в пробы буфер, содержащий 10 мМ ЭДТУК, в контрольные пробы добавляют 0,75 М NaCl, центрифугируют в течение 10 мин при 200 об/мин и определяют степень лизиса спектрофотометрически при длине волны 405 нм в супернатанте. Опытные пробы после добавления буфера, содержащего этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТУК), инкубируют дополнительно в течение 30 мин при 37°C. После инкубации степень лизиса определяют как в контрольных пробах. При разности степени лизиса между опытной и контрольной пробами более 10% оценивают как стабилизацию C3-конвертазы классического пути комплемента в сыворотке крови обследуемого.

Способ осуществляют следующим образом. Проводят забор крови, приготовление сыворотки, проведение гемолитического теста и расчет степени ингибирования лизиса. Гемолитический тест проводят с использованием стандартизованных эритроцитов барана (1,5×10⁸ кл/мл) (ЭБ) в вероналовом солевом буфере (VBS), содержащем 0,5 мМ MgCl₂ и 0,15М CaCl₂ (VBS²⁺). Время проведения экспресс-способа 40 мин (в прототипе - 80 мин).

Пример 1. Определение оптимальной концентрации буфера, содержащего 10 мМ ЭДТУК для полного ингибирования активации системы комплемента.

К 200 мкл суспензии эритроцитов барана (ЭБ) (1,5×108 кл/мл) добавляли 40 мкл разведенной 1:9 пулированной сыворотки крови человека от 10 здоровых доноров и 20-100 мкл VBS-E (интервал концентрации 0,4-2,0 ммоль/л ЭДТУК в системе), доводили объем до 500 мкл буфером VBS2+и инкубировали 30 мин при 37°C. Одновременно ставили контроль на спонтанный (200 мкл ЭБ+200 мкл VBS2+) и полный лизис ЭБ (200 мкл ЭБ+200 мкл H₂O). После инкубации останавливали реакцию гемолиза добавлением 2,5 мл охлажденного 0,15 М раствора NaCl, центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин и определяли степень гемолиза по величине A405 супернатанта. Степень лизиса эритроцитов (У) определяли по формуле:

У(%)=[(X-R)/(H-R)]×100,

где: H, R и X - величины оптической плотности A405 супернатанта в гемолитических системах при полном лизисе, в контроле спонтанного лизиса ЭБ и в опытной пробе, соответственно.

Степень ингибирования (СИ) определяли как разность показателей лизиса в контрольной пробе и в опытных пробах, содержащих возрастающие концентрации VBS-ЭДТУК, по формуле:

СИ(%)=(100-У),

где: 100 - степень лизиса в контрольной пробе, У - степень лизиса в опытных пробах. Полученные данные приведены в таблице 1.

Как видно из данных, представленных в таблице 1, лизис эритроцитов барана ингибируется дозозависимо при повышении концентрации ЭДТУК в гемолитической системе. Таким образом, при концентрации ЭДТУК в системе выше 1,4 мМоль/л наблюдается полное ингибирование гемолитической активности системы комплемента за счет хелатирования ионов кальция и магния.

Пример 2. Определение активности C3-конвертазы.

Определение активности C3-конвертазы классического пути основано на том, что после 10 мин инкубации 200 мкл (1,5×108 кл/мл) эритроцитов барана с 4 мкл сыворотки крови человека в конечном объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS2+, реакцию активации комплемента останавливают добавлением 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ ЭДТУК. В контрольную пробу сразу добавляют 2,4 мл охлажденного раствора 0,15 М NaCl, центрифугируют и определяют степень лизиса [У(контроль),%], как описано выше. Опытную пробу повторно инкубируют в течение 30 мин при 37°C. После инкубации определяют степень лизиса [У(опыт),%]. Активность C3-конвертазы определяют как разность между степенью лизиса в опытной и контрольной пробах. Проведены исследования активности C3-конвертазы в сыворотке крови 20 доноров. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, в 5 сыворотках активность C3-конвертазы была больше 10% и в среднем составила (13,8±2,0)%. В оставшихся 15 пробах среднее значение активности С3-конвертазы составило в среднем (3,8±1,9)%. Известно, что период полураспада С3-конвертазы составляет несколько минут, и при добавлении буфера, содержащего ЭДТУК, при связывании ионов CA²⁺ и Mg²⁺ полностью ингибируется активация комплемента по всем трем путям активации. Активность C3-конвертазы на уровне (3,8±1,9)% согласуется с литературными данными. Повышенная почти в 4 раза активность C3-конвертазы в 5 сыворотках свидетельствует о стабилизации C3-конвертазы классического пути активации системы комплемента. Чаще всего это связано с наличием аутоантител к активированной форме компонента C4, C4b. Данный эффект стабилизации C3-конвертазы может наблюдаться также и при дефиците фактора I, который является естественным ингибитором C3-конвертазы классического пути активации комплемента.

Таким образом, способ определения стабилизации C3-конвертазы позволяет выявлять скрытый аутоиммунный процесс у относительно здоровых людей, который впоследствии может приводить к патологии почек, иммунодефициту по компоненту C3, а при тяжелых случаях - к сепсису.

Пример 3. Определение стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента в сыворотках крови беременных женщин.

Предлагаемым способом были тестированы сыворотки крови 18 беременных женщин, пациентов отделения патологии, и общая активность системы комплемента в этих же сыворотках, как описано в работе Шойбонов Б.Б. и др. Коэффициент эффекторной функции антител (К_ЭФГА) - новый показатель состояния гуморального иммунитета // Патогенез. - 2011. - Т.9, №1, с.с.43-49. Кратко: 200 мкл эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами кролика, (ЭБ-А_К) (1,5×10⁸ кл/мл) инкубировали с разбавленной сывороткой крови человека в общем объеме 500 мкл, доведенном буфером VBS (концентрация сыворотки 0,4%). Одновременно ставили контроль на спонтанный гемолиз ЭБ-А_К (200 мкл ЭБ-А_К+300 мкл VBS²⁺) и контроль на полный лизис (200 мкл ЭБ-А_К+300 мкл H₂O). Пробирки встряхивали и инкубировали 30 мин при 37°C. После инкубации в пробы добавляли по 2,5 мл холодного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и определяли степень гемолиза по величине A₄₁₂ супернатанта. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, общая активность системы комплемента была снижена в 6-ти (35%) сыворотках из 17 тестированных, причем в этих же сыворотках выявлена повышенная активность C3-конвертазы классического пути активации комплемента. Только в сыворотке №13 повышенная активность C3-конвертазы не сопровождалась снижением общей гемолитической активности системы комплемента. Возможно, это связано либо с большими компенсаторными возможностями, либо же с более ранним выявлением аутоиммунного процесса в организме данного человека.

Таким образом, разработанная тест-система выявляет в 41% случаев скрытые аутоиммунные нарушения у беременных женщин. Обнаруженный факт стабилизации C3-конвертазы у беременных женщин может служить прогностическим показателем аутоиммунной природы ожирения в послеродовом периоде. Установлено, что при усиленном распаде компонента C3 образуются опсонин (C3b) и анафилотоксин (C3a). При инактивации анафилотоксина под действием карбоксипептидазы N образуется молекула C3a_dezArg, представляющая собой белок, стимулирующий ацилирование, т.е. стимулируется синтез нейтральных жиров.

Предлагаемый способ по сравнению с известными имеет преимущества, которые заключаются в повышении точности диагностики нарушений иммунного статуса, упрощении, сокращении длительности процедуры исследования до 40 минут, удешевлении, возможности использования в рутинных исследованиях. Реализация изобретения позволит контролировать эффективность проводимого лечения и выявлять доклинические состояния вторичных иммунодефицитов.

Таблица 1 Ингибирование лизиса эритроцитов барана 0,8% пулированной сывороткой крови человека буфером, содержащим 10 мМ ЭДТУК ЭДТУК в гемсистеме, мМ 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,8 2,0 0 СИ (%) 3 7 14 17 76 100 100 100 0

Таблица 2 Активность C3-конвертазы классического пути активации системы комплемента в сыворотках крови доноров № сыворотки У(опыт), % лизиса У(контроль), % лизиса Активность C3-конвертазы, % 1 72 60 12 2 12 10 2 3 49 36 13 4 89 77 12 5 7 3 4 6 12 10 2 7 11 5 6 8 8 4 4 9 13 10 3 10 15 13 2 11 18 15 3 12 90 84 6 13 12 13 1 14 53 37 16 15 16 14 2 16 16 21 5 17 10 3 7 18 81 77 4 19 57 41 16 20 13 7 6 M±m     6,3±4,8

Таблица 3 Активность C3-конвертазы классического пути активации системы комплемента в сыворотках крови беременных женщин № сыворотки Активность СК, % лизиса Активность C3-конвертазы, % 1 39 12 2 43 18 3 75 9 4 80 4 5 86 5 6 68 4 7 34 16 8 41 12 9 45 15 10 39 10 11 53 6 12 77 7 13 69 12 14 65 7 15 60 6 16 67 8 17 62 8 M±m 59±16 9,4±4,2

Изобретение относится к лабораторной диагностике, а именно к клинической иммунологии. Cпособ определения стабилизации C3-конвертазы классического пути активации комплемента человека осуществляется путем проведения реакции лизиса эритроцитов барана 0,8% сывороткой крови человека в течение 10 мин. Реакцию останавливают добавлением буфера, содержащего 10 мМ этилендиаминтетрауксусную кислоту, определяют степень лизиса эритроцитов в контрольной пробе. Опытную пробу дополнительно инкубируют в течение 30 мин при 37°C, определяют степень лизиса, рассчитывают активность C3-конвертазы как разность между опытной и контрольной пробами, при разнице более 10% оценивают как аутоиммунное патологическое состояние. Использование простого и быстрого в осуществлении способа позволяет выявлять доклинические состояния иммунодефицита, может служить специфическим маркером для иммуномодулирующей терапии, проводить углубленное исследование патогенеза аутоиммунных заболеваний. 3 табл., 3 пр.

Способ определения стабилизации C3-конвертазы классического пути активации системы комплемента путем проведения в контрольной и опытной пробах реакции лизиса эритроцитов барана сывороткой крови человека при температуре 37,0±0,5°C с последующим выявлением лизиса эритроцитов, отличающийся тем, что лизис эритроцитов барана проводят 0,8% сывороткой крови человека в течение 10 мин, останавливают реакцию добавлением буфера, содержащего 10 мМ ЭДТУК, определяют степень лизиса эритроцитов в контрольной пробе, опытную пробу дополнительно инкубируют в течение 30 мин при 37°C и определяют степень лизиса эритроцитов, а активность C3-конвертазы рассчитывают как разность между степенями лизиса в опытной и контрольной пробах, при этом разность более 10% оценивают как аутоиммунное патологическое состояние.