Способ получения иммобилизованных бактериальных клеток Советский патент 1989 года по МПК C12N11/08 

(21)4278459/28-13

(22)02.06.87

(46) 15.05.89. Бкш. № 18

(71)Ленинградский институт текстильной и легкой промышленности

им. С.М. Кирова

(72)А.Б.Лобова, И.И.Шамолина, С.С.Ставская, Л.А.Таранова и О.С.Рад- ченко

(53) 577.15(088.8)

(56)Синицыи А.А. и др. Иммобилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae на алюмоборосиликатных стекловолокнах. Биотехнология , 1986, К 3,

с. 66-69.

Патент США № 4177107, кл. С 07 G 7/02, 1979.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

(57)Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способам получения микробных клеток-деструкторов анионных поверхностно-активных веществ. Целью изобретения является упрощение процесса и повышение активнести иммобилизованных клеток при деструкции анионных поверхностно-активных веществ. Способ заключается в иммобилизации бактериальных клеток путем смешивания водной суспензии клеток-деструкторов анионных поверхностно-активных веществ Pseudomonas aeruginosa 1C или P. alcaligenes TR с анионообменным поливинилспиртовым или поликапроамидным волокном, содержащим химически закрепленный флоку- лянт, и проведении связывания при модуле ванны 20-30, температуре 28-33°С в течение 20-30 мин. При этом голи- винилспиртовое или поликапроамидное волокно содержит 1-1,5 мель полиэти- ленимина и/или полиэпоксидоамина на 1 г волокна, а его обработку осуществляют водной суспензией микробных клеток с концентрацией 0,6-1,0 ед. оптической плотности. Способ упрощает процесс иммобилизации бактериальных клеток и позволяет увеличить их активности при деструкции анионных поверхностно-активных веществ в 4- 6 раз. 1 з.п. ф-лы, 1 таол.

Ј

vJ

СЈ

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к способам получения микробных клеток-деструкторов анионных поверхностно-активных веществ. Целью изобретения является упрощение процесса и повышение активности иммобилизованных клеток при деструкции анионных поверхностно-активных веществ. Способ заключается в иммобилизации бактериальных клеток путем смешивания водной суспензии клеток - деструкторов анионных поверхностно-активных веществ PSEUDOMONAS AERUGINOSA 1 С или P.ALCALIGENES TR с анионообменным поливинилспиртовым или поликапроамидным волокном, содержащим химически закрепленный флокулянт, и проведении связывания при модуле ванны 20-30, температуре 28-33°С в течение 20-30 мин. При этом поливинилспиртовое или поликапроамидное волокно содержит 1-1,5 моль полиэтиленимина и/или полиэпоксидоамина на 1г волокна, а его обработку осуществляют водной суспензией микробных клеток с концентрацией 0,6-1,0 ед. оптической плотности. Способ упрощает процесс иммобилизации бактериальных клеток и позволяет увеличить их активности при деструкции анионных поверхностно-активных веществ в 4-6 раз. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению иммобилизованных микробных клеток-дест- ,рукторов анионных поверхностно-активных веществ (АПАВ), которые могут быть использованы как катализаторы со специфической и контролируемой активностью в очистке вредных промыш- ленных выбросов ряда химических производств .

Цель изобретения - упрощение процесса и повышение активности иммобилизованных клеток при деструкции анионных поверхностно-активных веществ.

Способ получения иммобилизованных клеток деструкторов АПАВ заключается в смешивании водной суспензии клеток Pseudomonas alcaligenes TR (ВКПМ В-2981) или Pseudomonas aeruginosa 1C с пористым адсорбентом - анионо

3-

обменным полипиштлспиртовым или по- пикамроамидным волокном, содержащим химически закрепленный флокулянт полиэтиленимин и/или полизпоксидо- амин в количестве 1,0-1,5 моль на 1 г адсорбента, а иммобилизацию осуществляют при модуле ванны 20-30, температуре 28-ЗЗ С в течение 20- 30 мин. Предпочтительно использовать водную суспензию клеток с концентрацией 0,6-1,0 единиц оптической плотности .

Поливинилспиртовое или поликапро- амидное волокно, 1 г которого содержит 1-1,5 моль химически закрепленного флокулянта, обладает повышенным сродством к микробным клеткам-деструкторам анионных поверхностно-активных веществ за счет включения поли- этиленимина и/или полиэпоксидоамина в структуру носителя. Это позволяет осуществлять иммобилизацию клеток в течение 20-30 мин в мягких условиях без использования сложного оборудования, необходимого для -облучения Закрепление микробной клетки на некотором расстоянии от волокнистой матрицы через содержащиеся в волокне молекулы химически связанного полиэтиленимина и/или полиэпоксидоамина обеспечивает этой клетке большую подвижность, чем если бы последняя находилась в массе полимера, улучшает доступ к ней субстрата, способствует эффективной работе фермент ной системы иммобилизованной микробной клетки и полному сохранению ее активности.

Использование предлагаемого способа позволяет упростить процесс за (счет устранения стадии радиационной полимеризации, а также повысить активность иммобилизованных клеток при деструкции анионных поверхностно- активных веществ от 1,5-3,6 (при пол ном сохранении активности клеток) до 9,2-15,3 мг деструктированных АПАВ на 1 мг клеток, т.е. в 4-6 раз.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Анионообменное по- ливинилспиртовое волокно (1 г), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 1 моль/г, обрабатывают я течение 20 мин водной суспензией микробной культуры P.al- caligenes TR (ВКПМ В-2981) (20 мл) с концентрацией клеток 0,6 ед. оптической плотности при 28 С. Волокно

0

5

)

5

5

0

5

0

0

высушивают нл воздух, а т л т ем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 12 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 9,2 мг деструктированного АПАВ на мг клеток (таблица).

П р и м е р 2. Анионообменное по- ливинилспиртовое волокно (1 г), содержащее химически закрепленный по- лиотиленимин в количестве 1,3 моль/г, обрабатывают в течение 25 мин водной суспензией микробной культуры P.alca- ligenes TR (25 мл) с концентрацией клеток 0,8 ед. оптической плотности при температуре 30°С... Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 15 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 9,6 мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток.

П р и м е р 3. Анионообменное по- ливинилспиртовое волокно (1 г), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 1,5 моль/г, обрабатывают в течение 30 мин водной суспензией микробной культуры P.alca- ligenes TR (30 мл) с концентрацией клеток 1,0 ед. оптической плотности при 33°С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 21 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне ,11,8 мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток.

П р и м е р 4. Анионообменное Поливинилспиртовое волокно (1 г), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин в количестве 0,6 моль/г обрабатывают в течение 20 мин водной суспензией микробной культуры P.alca- igenes TR (20 мл) с концентрацией клеток 0,6 ед. оптической плотности при 28°С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 6 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне снижается в два раза - до 5,0 мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток.

Анионообменное Поливинилспиртовое (поликапроамидное) волокно, содержащее флокуляит в количестве более 1,5 моль на 1 грамм, обладает низкой прочностью и повышенной хрупкостью,

no-irony исппль u H iT) его ;шя пммобн- пизлшш микробных клеток представляется нецелесообразным.

Пример 5, Анионообмонное по- ливишшспнртовое( 1 г) волокно, содержащее химически закрепленный по- лиэтиленимин в количестве 1,3 моль/г, обрабатывают в течение 30 мин водной суспензией микробной культуры P.aeru- ginosa 1C (30 мл) с концентрацией клеток 0,9 ед. оптической плотности, при 30°С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают.дистиллированной водой. Содержание клеток, им- мобилизованных на волокне, составляет 23 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, равна 15,5мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток .

П р и м е р 6. Анионообменное попивинилспиртовое волокно (1 г),содержащее химически закрепленный по- лиэпоксидоамин в количестве 1,2 моль/г, обрабатывают в течение 25 мин водной суспензией микробной культуры P.alcaligenes TR (25 мл) с концентрацией клеток 0,8 ед. оптической плотности при 30°С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промы- вают-дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 18 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 11,2 мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток.

Пример 7. Анионообменное поликапроамидное волокно (1 г), содержащее химически закрепленный по - лиэпоксидоамин в количестве 1, 1 моль/г, обрабатывают в течение 20 мин водной суспензией микробной культуры P.aeruginosa 1C (20 мл) с концентрацией клеток 0,7 ед. оптической плотности при 28°С.Волокно высушивают на воздухе,а затем промывают .дистиллированной водой.Содержание клеток,иммобилизованных на волокне, составляет 13 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 9,1 мг дест- руктированного АПАВ на мг 1 клеток.

П р и м е р 8. Анионообменное поликапроамидное волокно (1 г), содержащее химически закрепленный по- лиэпоксидоамин в количестве 1,0 моль/г обрабатывают в течение 20 мин водной суспензией микробной культуры P.alcaligenes TR (25 мл) с концентрацией клеток 0,6 ед. оптической плотности

5

5 о

5

0 5 0

5

при 28°С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 12 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне 9,3 мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток.

П р и м е р 9. Анионообменное поликапроамидное волокно (1 г), содержащее химически закрепленный по- лиэтиленимин в количестве 1,2 моль/г, обрабатывают в течение 25 мин водной суспензией микробной культуры P.alcaligenes TR (30 мл) с концентрацией клеток 0,8 ед. оптической плотности при 30°С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 15 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 9,9 мг деструктированного АПАВ на мг клеток.

Пример 10. Анионообменное поликапроамидное волокно (1 г), содержащее химически закрепленный по- лиэтиленимин в количестве 1 ,4 моль/г, обрабатывают в течение 30 мин водной суспензией микробной культуры P.aeruginosa 1C (30 мл) с концентрацией клеток 1,0 ед. оптической плотности при 33°С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 22 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 14,2 мг деструктированного АЛАВ на 1 мг клеток.

Пример 11. Анионообменное поливинилспиртовое волокно (1 г), содержащее химически закрепленный полиэтиленимин и полиэпоксидоамин в количестве 1,3 моль/г, обрабатывают в течение 25 мин водной суспензией микробной культуры P.alcaligenes TR (28 мл) с концентрацией клеток 0,9ед. оптической плотности при 30°С. Волокно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных на волокне, составляет 21 мг/г. Активность клеток, иммобилизованных на волокне, 12,6 мг деструктированного АПАВ на 1 мг клеток.

Пример 12. Анионообменное поликапроамидное волокно (1 г), содержащее химически закрепленные полиэтиленимин и полиэпоксидоамин в количестве 1,2 моль/г, обрабатывают

в ic iPHiif1 }() млн водной гуспензней микробной куиьтуры P.aeruginosa 1C (26 мл) с концентрацией кчеток 1,0ед оптической плотности при 33°С. Во- покно высушивают на воздухе, а затем промывают дистиллированной водой. Содержание клеток, иммобилизованных па волокне, составляет 20 мг/г Активность клеток, иммобилизованных на волокне, равна 13,4 мг деструкти- рованного ЛПЛВ на мг клеток.

Пример ы 13-24. Иммобилизацию проводят, как описано в примерах 1-12, варьируя содержание ПЭИ и/или IDA в составе гюликапроамидного (13-18 примеры) ипи поливинилспирто- вого (19-24) волокон.

Примеры 25-32. Иммобилизацию проводят, как описано в примерах 1-12, изменяя модуль волны (объем суспензии в 1 мг, добавленный на 1 г волокна), температуру, продолжительность иммобилизации и концентрацию клеток в суспензии.

Диализ данных примера 25 показывает, что уменьшение модуля обработки (соответственно, объема суспензии в 1 мл необходимого для обработки 1 г волокна) до 15 приводит к снижению количества клеток, закрепляемых на волокне, вследствие недостаточного количества обрабатывающей суспензии и неравномерности обработки носителя. Увеличение модуля до 35 (пример 26) нецелесообразно, поскольку при возрастании объема обрабатывающей суспензии волокно (при прочих равных условиях иммобилизации) сорбирует - в силу своей анионообменной емкости и структурных особенностей - такое же количество клеток, как и при модуле 30 (пример 3).

Уменьшение концентрации клеток в суспензии до 0,4 ед. опт. плотности при модуле обработки 20 (пример 27) не обеспечивает высокое содержание, клеток на волокне вследствие их недостаточного количества в исходной суспензии, тогда как использование для иммобилизации суспензий с повышенной концентрацией клеток (пример 28), no-первых, тэтрудняет процесс иммобилизации вследствие агрегирования Пактерий в концентрированных растворах, во-вторых, в любом случае не удается закреплять на волокне Kue.Tim г, количестве большем, чем почлоляю1 мкогтные и структур

0

5

0

5

0

5

0

5

ныс особенности предлагаемого носи- теня .

Продолжительность обработки определяется периодом, после которого наступает равновесие между клетками, иммобилизованными на волокне и находящимися в свободном состоянии в суспензии. Следовательно, уменьшение времени контакта волокон с суспензией клеток (пример 29) не позволяет достигнуть такого равновесия, вследствие чего на волокне успевает закрепиться необходимое количество клеток. После наступления равновесия продолжение иммобилизации (увеличе- ние времени контакта клеток с волокном - пример 30) нецелесообразно, так как с носителем уже связалось такое количество клеток, которое максимально возможно при прочих равных условиях (пример 3).

Аналогичные закономерности наблюдаются и при уменьшении (ниже 28°С) либо при увеличении (выше 33°С) температуры иммобилизации (примерь 31 и 32).

Описанные примеры (для удобства сравнения) приведены для ПВС волокна, содержащего ПЭИ в количестве 1,0 и 1,5 моль/г, и микробной культуры P.alcaligenes TR. Однако подобные закономерности распространяются и на все прочие виды волокон, которые приведены в примерах 1-24, а также оба вида микробных культур.

Активности бактерий-деструкторов АПАВ определяют по изменению концентрации АПАВ (додецилсульфата натрия - для культуры P.aeruginosa 1C и ал- килбензолсульфаната - для культуры P.alcaligenes TR) в водном растворе колориметрически по реакции с мети- леновым синим и выражают в 1 мг снижения концентрации соответствующего АПАВ на 1 мг свободных или иммобилизованных клеток. При этом содержание клеток в водном растворе АПАВ подбирают равным количеству клеток, иммобилизованных на г волокна, i

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет упростить процесс за счет исключения стадии радиационной полимеризации и повысить активность иммобилизованных клеток при деструкции АПАВ в 4-6 раза - от 1,5-3,6 до 9,2-15,3 мг деструктиро- ванного АПАВ на 1 мг клеток, поскольку активность клеток в известном спогобе при пммпбмди ьшин сохраняется, а в предлагаемом возрастает в 4- 6 раз .

Формула изобретения

0

веществ, иммобилизации подвергают клетки Pseudomonas aeruginosa 1C или P.alcaligencs ВКПМ В-2981, в качестве адсорбента используют анионооб- менное поливигашспиртовое или поли- капроамидное волокно, содержащее 1,0-1,5 моль полиэтиленимина и/или полиэпоксидоамина на 1 г волокна, а инкубацию проводят в течение 20- 30 мин при 28-33°С, устанавливая соотношение суспензии клеток - адсорбент, равным 20-30 мл на 1 г адсорбента.

2. Способ по п. отличающийся тем, что концентрацию клеток в водной суспензии устанавливают равной 0,6-1,0 единицам оптической плотности.