СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО БИОКАТАЛИЗАТОРА НА ОСНОВЕ ЛИПАЗЫ, ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА АНИОНООБМЕННЫХ СМОЛАХ АВ-16-ГС И АН-12П В OH-ФОРМЕ Российский патент 2024 года по МПК C12N11/02 C12N9/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, пищевой промышленности. Изобретение может применяться при создании препаратов для гидролиза молочного жира, для производства и улучшения качества сыров.

Липаза (КФ 3.1.1.3) катализирует разложение триглицеридов до ди- и моноглицеридов, глицерина и жирных кислот. Фермент обладает чрезвычайно широкой субстратной специфичностью и способностью к восприятию широкого спектра структурно разнообразных сложных жиров, спиртов и карбоновых кислот в качестве субстратов. Липазы стабильны и активны в органических растворителях [А.М. Безбородов, Н.А. Загустина. Липазы в реакциях катализа в органическом синтезе // Прикладная биохимия и микробиология. -2014.-Т. 50, №4.-С. 347-373].

Липазы относятся к суперсемейству α/β гидролаз, обладают интерфазной активацией. Активный центр образован остатками аминокислот Ser-His-Asp/Glu и покрыт lid-доменом. Для термостабильных липаз характерен крупный lid-домен с двумя или более α-спиралями, а для мезофильных липаз характерна структура меньшего размера, состоящая из одной петли или α-спирали. Именно этот домен позволяет липазам существовать в двух конформациях - открытой и закрытой. На границе раздела фаз масло-вода происходит активация фермента путем конформационного изменения, сопровождающегося смещением lid-домена, что открывает карман, связывающий субстрат [Самойлова Ю.В., Сорокина К.Н., Пилигаев А.В. и др. Применение бактериальных термостабильных липолитических ферментов в современных биотехнологических процессах // Катализ в промышленности. - 2018. Т. 6. - С. 61-73]. Липазы стабильны и проявляют активность в диапазоне рН 4,0-8,0 [P. Chandra, Enespa, R. Singh et al. Microbial lipases and their industrial applications: a comprehensive review // Microb Cell Fact. -2020. V. 19, №169.-P. 1-42].

В настоящее время липазы используются в молочной промышленности для гидролиза молочного жира, в сыроделии для улучшения вкуса сыров, ускорения созревания сыра, а также в переработке кислых масел [Стурова Ю.Г., Гришкова А.В. Исследование активности прегастральных липаз // Ползуновский вестник. - 2019. Т. 4. - С. 29-33].

Развитие энзимологии способствует созданию биокатализаторов нового типа -иммобилизованных ферментов. Иммобилизация - распространенный метод повышения стабильности ферментов к денатурирующим воздействиям внешней среды, способствующий многократному применению биокатализаторов в фармацевтической, пищевой промышленности, а также в аналитических целях. К соединениям, используемым в качестве нерастворимых носителей, предъявляются высокие требования: с одной стороны, молекула фермента после иммобилизации не должна претерпевать существенных структурно-функциональных изменений, с другой - она должна быть прикреплена к матрице необратимо. К перспективным носителям относят ионообменные смолы [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М. и др. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах / Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. Т. 5, №5. - С. 704-711].

Ионообменные смолы - это нерастворимые полимеры, представляющие собой высокомолекулярные синтетические соединения с трехмерной гелевой или макропористой структурой, которые содержат различные функциональные группы, способные осуществлять ионный обмен [K. Biswas, S. Ghosh, В. Basu. Ion-exchange Resins and Polypeptide Supported Catalysts: A Critical Review // Current Green Chemistry. - 2020. - V. 7. - P. 40-52]. Ионообменные смолы можно разделить на катионо-, анионообменные и амфотерные. Катиониты обмениваются положительно заряженными ионами, проявляя кислотные свойства. Аниониты обменивают отрицательно заряженные ионы, проявляя основные свойства. Амфотерные иониты одновременно содержат кислотные и основные ионогенные группы и в зависимости от условий проявляют себя как катиониты или аниониты [Ольшанникова С.С, Сакибаев Ф.А., Холявка М.Г. и др. Разработка методики адсорбционной иммобилизации трипсина на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2021. - Т. 21, №3. - С. 408-416].

Свойства и области применения ионообменных материалов в основном зависят от особенностей диссоциации их функциональных групп.Сильноосновные смолы протонируются во всем диапазоне рН и способны обмениваться анионами как в кислых, так и в щелочных растворах. Сильноосновные смолы могут поглощать слабые кислоты и даже ионизировать очень слабо диссоциированные кислоты. Слабоосновные обменники протонируются при значениях рН ниже 8 и могут работать только в кислых средах. Они обычно не могут адсорбировать слабую кислоту. Также выделяют среднеосновные аниониты, которые протонируются в значениях рН от 0 до 5 [W.Н. Нöll. Anion Exchangers: Ion Exchange // Water Treatment/Anion Exchangers: Ion Exchange. - 2000. - V. 3. - P. 4477-484].

В зависимости от способа получения анионообменные смолы делят на полимеризационные и поликонденсационные. Благодаря более высокой химической и термической стойкости, а также повышенной механической прочности поликонденсационные смолы заняли ведущее место в производстве ионообменных материалов.

Ионообменная смола обладает двумя основными характеристиками -ионообменной емкостью и селективностью. Ионообменная емкость определяется способностью функциональной группы подвергаться вытеснению ионов, которые свободно присоединяются к ее структуре противоположно заряженными ионами, доступными в окружающем растворе. Ионообменные смолы применяются в различных сферах производства: в теплоэнергетике для умягчения и обессоливания воды, в гидрометаллургии для разделения цветных металлов, для регенерации отходов гальванотехники и металлообработки, в органическом синтезе в качестве катализатора, при очистке сточных вод, в пищевой промышленности. Ионообменные смолы могут выступать в качестве носителя для иммобилизации ферментов, тем самым они расширяют горизонты своего применения в промышленности и фармации [Holyavka M.G., Kayumov A.R., Baydamshina D.R. et al. Efficient fructose production from plant extracts by immobilized inulinases from Kluyveromyces marxsianus and Helianthus tuberosus / International Journal of Biological Macromolecules. - 2018. - Vol. 115. - P. 829-834].

Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2389792 С2, МПК C12N 9/20, C12N 11/12, опубл. 20.05.2020, Бюл. №14], включающий растворение пищевой карбоксиметилцеллюлозы в буферном растворе или подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавление к фильтрату полученного раствора панкреатической липазы или микробной липазы из культуры Aspergillus niger, или их смеси с активностью не ниже 100 ед./г в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества, интенсивном перемешивании со скоростью 4500-5000 об/мин, после чего образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, уменьшают рН реакционной смеси до 3,0-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы, содержащие липазу, отделяют и высушивают.

В данном способе иммобилизация липазы проводится на растворимом носителе, который, безусловно, имеет свои преимущества, но может быть легко подвержен заражению микробной микрофлорой и неустойчив к воздействию сильных кислот, щелочей и окислителей.

Известен способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 2301831, МПК C12N 9/20, C12N 11/08, опубл. 27.06.2007], включающий иммобилизацию липазы в полидиаллилдиметиламмоний хлориде при массовом соотношении липаза:полидиаллилдиметиламмоний хлорид 1:1-100 при рН 7,6-8,2, температуре 18-24°С в течение 10-20 минут. В отличие от него наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу в нерастворимой форме, т.е. гетерогенный биокатализатор, т.к. применяемые нами в качестве носителей ионообменные смолы не растворимы в воде.

Существует способ получения иммобилизованной липазы [Патент RU 1696475 А1, МПК C12N 11/08, C12N 9/18 опубл. 07.12.1991, Бюл. №45], включающий обработку полиамидного носителя бифункциональным реагентом, несущим изоцианатные группы, в нейтральной или слабощелочной среде и последующее связывание липазы с модифицированным носителем, в качестве бифункционального реагента используют 2,4-толуолдииэоцианат в количестве 1-2 мг на 1 г носителя, а после обработки бифункциональным реагентом проводят модификацию носителя пальмитиновой кислотой, устанавливая соотношение 20-30 мл пальмитиновой кислоты на 1 г носителя.

Недостатком изобретения является использование 2,4-толуолдииэоцианата в качестве бифункционального реагента, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.

Анионообменная смола АВ-17-2П уже рассматривалась в литературе в качестве носителя для иммобилизации липазы из Rhizopus japonicus 1403 [Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Багно О.П., Трофимова О.Д., Беленова А.С.Иммобилизация гидролитических ферментов на анионитах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2008. - Т. 8. Вып. 6. - С. 1035-1041; Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Трофимова О.Д., Беленова А.С, Воропаева Е.Н. Исследование термодинамических аспектов реакции гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005 - Т. 5. Вып. 3. - С. 353-360]. Авторы показали, что оптимальным методом иммобилизации является модифицированный глутаральдегидный способ ковалентного связывания фермента с носителем, заключающийся в процессе наращивания связывающего звена между липазой и анионитом при обработке рядом органических реагентов. Иммобилизация липазы адсорбционным методом на товарных анионообменных смолах АВ-26 и АВ-17-2П не дала положительных результатов [Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Кожокина О.М., Селеменев В.Ф., Трофимова О.Д., Холявка М.Г., Китаева Т.А. Исследование условий иммобилизации некоторых гидролитических ферментов на ионообменных смолах // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2005. - Т. 5. Вып. 5. - С. 704-711].

Недостатком предложенного этими авторами метода является использование глутарового альдегида в качестве сшивающего агента, что ограничивает применение препарата в пищевой, фармацевтической промышленности и медицине.

Описан способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В [Патент RU 2650668 С1, МПК C12N 9/16, C12N 11/08, опубл. 13.12.2016, Бюл. №11], включающий избирательную адсорбцию липазы из Candida antarctica фракции В на гидрофобном макропористом носителе в процессе инкубации частиц носителя в водном концентрате культуральной жидкости штамма дрожжей Pichia pastoris ВКПМ Y-4298 с удельной ферментативной активностью не менее 350 ЛЕ/мг белка и последующую ковалентную модификацию адсорбированного фермента глутаровым альдегидом, добавляемым непосредственно в инкубационную суспензию до конечной концентрации его 1,0-2,5%. Процесс инкубации продолжают в течение 30-120 мин.

В отличие от этого изобретения предлагаемый нами способ позволяет получить иммобилизованную липазу адсорбционным методом без дальнейшей ковалентной модификации.

Известен способ иммобилизации липазы CALB путем адсорбции на сополимере дивинилбензола и метакрилата, выпускаемом компанией Purolite®Life Sciences под маркой Lifetech™ ECR 1030М [Basso A., Froment L., Hesseler М., Serban S. New highly robust divinyl benzene/acrylate polymer for immobilization of lipase CALB // Eur. J. Lipid Sci. Technol. - 2013. - V. 115. - P. 468-472], в котором для иммобилизации используют липазу CALB в виде водного раствора (коммерческий препарат Lipozyme®CALB L, компания Novozymes) с удельной гйдролазной (липазной) активностью (по гидролизу трибутирина) 330 мкмоль/мг белка. Перед использованием в растворе CALB устанавливают рН 7,5 и инкубируют раствор с носителем при перемешивании в течение ночи. Затем внешний раствор отделяю вакуумной фильтрацией, носитель с адсорбированной CALB однократно промывают 0,02 М фосфатно-натриевым буфером, рН 7,5, и высушивают в токе азота.

Описаны способы сорбции липаз на ионообменных материалах [CN108148827A, CN 101712951 A, CN 106867989 A, JP H01273588 A, JPH 03160992 A, US 5273898 A, WO 2015081879 A1], в том числе Amberlite, Duolite, Purolite [WO 2008084470 A2, CN 102839166 A], Lewatit, Dowex [US 5292649 A], различных типах органических и неорганических полимерных смол [RU 2573929, CN 114657169 A], ковалентной иммобилизации этих же ферментов на названных типах носителей [WO 2008139455 A2], а также способы получения мультилипазных препаратов [WO 2009069116 A2] Перечисленные выше подходы не позволяют полностью удалить несвязанную с носителем форму липазы, которая в дальнейшем может попадать в целевой продукт.

Известны способы иммобилизации липазы на различных типах носителей путем абсорбции, ионного связывания, ковалентного связывания, включения в гели, мембраны, а также способы получения иммобилизованной липазы путем комбинирования этих методов [US 2010210745 A1]. Однако ни в одном из этих способов не доказано, что получаемый иммобилизованный препарат полностью очищен от несвязавшегося фермента.

В качестве прототипа был выбран способ получения препарата иммобилизованной липазы (ЕР0140542А1), согласно которому 2,20 г липазы Muсor miehei растворяли в 20 мл воды, смешивали с 10 г промытой (8,5 г сухой массы) ионообменной смолы Duolite ES 562, смесь доводили до рН 5,0 и оставляли на 4 часа при 5°С при перемешивании магнитной мешалкой. После фильтрации и промывки небольшим количеством воды препарат сушили в вакууме при комнатной температуре. Активность, оставшаяся в фильтрате, составила 8% от общего исходного количества.

В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованную липазу с более высокой гидролазной активностью. Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для стабилизации липазы. Кроме того, гетерогенный катализатор включает только иммобилизованную липазу и полностью отмыт от ее неиммобилизованной формы.

Технический результат заявленного изобретения заключается в получении гетерогенного, нерастворимого в воде биокатализатора на основе липазы из поджелудочной железы свиньи, иммобилизованной адсорбционным методом на анионообменных смолах АВ-16-ГС или АН-21А, включающего только иммобилизованную (стабилизированную) липазу и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, обладающего более высокой общей и удельной активностью, равной 29 мкмоль и 10700 мкмоль/мг, соответственно, для липазы, иммобилизованной на АН-12П, а также 22,5 мкмоль и 11900 мкмоль/мг, соответственно, для липазы, иммобилизованной на АВ-16-ГС, по сравнению с прототипом, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на анионообменных смолах АВ-16-ГС И АН-12П в ОН-форме, включающем адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу анионообменника в процессе инкубации липазы и анионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на анионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; согласно изобретению, перед иммобилизацией анионообменник в ОН-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г анионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г анионообменной смолы АВ-16-ГС или АН-12П в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 3 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и, предшествующего ей, выдерживания анионообменника используют 0,05М глициновый буфер с рН 10,5, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на анионообменнике проводят путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантацией внешнего раствора, промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.

Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.

Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в мкмоль жирных кислот) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.

Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) в препаратах липазы, иммобилизованной адсорбционным методом на ионообменных смолах.

Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования была выбрана липаза из поджелудочной железы свиньи, фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил трибутирин фирмы Acros. В качестве носителей для иммобилизации были рассмотрены ионообменные смолы ЭДЭ-10 (ГОСТ 20301-74), АМ-21, АВ-16-ГС (ГОСТ 20301-74), PUROLITE А100, АН-12П (Уральская химическая компания, Россия). Анионит ЭДЭ-10П - промежуточной основности, представляет собой полифункциональный анионит, содержит вторичные и третичные аминогруппы алифатического ряда и около 20% групп четвертичных аммонийных оснований. ЭДЭ-10П получают поликонденсаций полиэтиленполиаминов с эпихлоргидрином. AM 21А - сильноосновный анионит полистирольной природы. По классификации ионообменных смол АВ-16-ГС является анионитом, синтезированным путем поликонденсации полиэтиленполиамина, эпихлоргидрина и пиридина. АН-12П -полифункциональный анионит, содержит в качестве ионогенных групп вторичные и третичные аминогруппы алифатического ряда. Анионит PUROLITE А100 является аналогом ионитов группы АН и содержит в качестве ионогенных групп вторичные и третичные аминогруппы алифатического ряда [Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические носители. - М.: Химия, 1972. - 320 с; Бруцкус Т.К., Замбровская Е.В., Самборский И.В. Иониты. Каталог.- Черкассы, 1975. - 36 с.].

Перед проведением иммобилизации исследуемые образцы ионообменных смол помещали в насыщенный раствор NaCl на 3-4 ч для предотвращения растрескивания гранул, далее сорбент переносили в колонку и промывали дистиллированной водой. Для удаления минеральных примесей ионит сначала обрабатывали растворами НС1 в количестве 5 объемов на 1 объем смолы в нарастающей концентрации 0,5-3,0 М до отсутствия ионов железа в промывных водах, а затем обработку соляной кислотой повторяли при соответствующем уменьшении концентрации кислоты и отмывали смолу дистиллированной водой до нейтральной реакции. Следующей стадией подготовки ионитов-носителей была обработка растворами гидроксида натрия в нарастающей концентрации 0,1-0,25 М, после которой смолы отмывали дистиллированной водой. Для более полного удаления примесей кислотно-щелочную обработку проводили троекратно. После очистки ионит переводили в ОН-форму. Подготовленный таким образом носитель высушивали до постоянной массы при комнатной температуре и хранили в емкости с плотно притертой крышкой [Создание гетерогенного ферментного препарата на основе иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus.. Холявка М.Г. [и др.] // Биотехнология. -2012. - №6. - С. 31-42].

Иммобилизацию липазы на матрице ионообменной смолы осуществляли адсорбционным методом. 1 г воздушно сухой предварительно кондиционированной анионообменной смолы в ОН-форме оставляли на 12 ч при комнатной температуре в 20 мл 0,05М глицинового буфера с рН 10,5. После чего 10 мл раствора липазы в 0,05М глициновом буфере с рН 10,5 в концентрации липазы 3 мг/мл добавляли к суспензии носителя в буфере и перемешивали в колбе с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Полученную смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин, внешний раствор декантировали, осадок промывали до отсутствия белка в промывных водах с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 грамма полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Контроль наличия или отсутствия белка в промывных водах осуществляли с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.

Содержание белка в иммобилизованных препаратах липазы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].

Определение каталитической активности липазы проводили на субстрате трибутирине [Беленова А.А. Исследование закономерностей гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой: дис. к.б.н. 03.01.02 / Беленова А.С. - Воронеж, 2011. - 162 с.]. Реакционную смесь объемом 2 мл, содержащую 0,5 мл эмульсии субстрата в 0,2 М фосфатно-цитратном буфере, рН 6,5, инкубировали при 37°С с образцом иммобилизованного фермента в течение 15 мин. Отбирали 1 мл реакционной смеси и добавляли 1 мл 0,1 М HCl в этаноле для остановки реакции. Далее для количественного определения образующихся в ходе гидролиза жирных кислот к этой смеси добавляли 5 мл гексана, встряхивали, и после расслоения из гексанового слоя отбирали 1 мл пробы и вносили в пробирку с 3 мл цветного реагента родамина 6Ж. Интенсивность образующейся окраски измеряли через 20 мин при длине волны 515 нм. Для определения содержания жирных кислот использовали калибровочную кривую, построенную по пальмитиновой кислоте.

Удельную активность липазы выражали в мкмоль жирных кислот, выделившихся за 1 мин в расчете на 1 мг белка, и рассчитывали по формуле:

А=a/B⋅t,

где а - количество вещества жирных кислот, мкмоль;

В - содержание белка в препарате, мг;

t - время гидролиза, мин.

Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты отражены на фиг. 1-3.

Наибольшее количество белка в гетерогенных препаратах (в мг на г носителя) наблюдалось при иммобилизации липазы адсорбционным методом на анионообменной смоле АМ-21 (фиг. 1). Высокие значения общей активности липазы (в мкмоль жирных кислот) были зарегистрированы при ее сорбции на АН-12П (фиг. 2). Наибольшую удельную активность показали препараты липазы, иммобилизованной с помощью адсорбционного метода на матрицах АВ-16-ГС и АН-12П (фиг. 3). Таким образом, оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в мкмоль жирных кислот) и удельной активности (в мкмоль на 1 мг белка в пробе) было получено при адсорбции липазы на анионитах АВ-16-ГС и АН-12П.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на анионообменных смолах, включающий адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу анионообменника, в процессе инкубации при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на анионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером; при этом перед иммобилизацией анионообменник в ОН-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г анионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии анионообменной смолы АВ-16-ГС или АН-12П 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 3 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05М глициновый буфер с рН 10,5, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании с помощью электрической мешалки со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 5 мин, декантацию внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободной липазы. Изобретение позволяет получить гетерогенный, нерастворимый в воде биокатализатор на основе липазы из поджелудочной железы свиньи с более высокой активностью, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с более высокими скоростями. 3 ил.

Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной на анионообменных смолах АВ-16-ГС И АН-12П в ОН-форме, включающий адсорбционную иммобилизацию липазы в буферном растворе на матрицу анионообменника в процессе инкубации липазы и анионообменника в буферном растворе при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на анионообменнике, промывку образовавшегося биокатализатора буфером, отличающийся тем, что перед иммобилизацией анионообменник в ОН-форме выдерживают в течение 12 ч при комнатной температуре в буфере, из расчета на 1 г анионообменника используют 20 мл буфера, иммобилизацию ведут путем добавления к суспензии, содержащей 1 г анионообменной смолы АВ-16-ГС или АН-12П в 20 мл буфера, 10 мл раствора липазы из поджелудочной железы свиньи в буфере в концентрации липазы 3 мг/мл, в качестве буферного раствора для иммобилизации и, предшествующего ей, выдерживания ионообменника используют 0,05М глициновый буфер с рН 10,5, после чего осуществляют инкубацию при перемешивании со скоростью 250 об/мин в течение 1,5 ч, затем проводят отделение внешнего раствора от иммобилизованной липазы на анионообменнике путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин и последующей декантации внешнего раствора; промывку образовавшегося биокатализатора осуществляют с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 1 см длины, с диаметром пор 25 кДа против 0,2М фосфатно-цитратного буфера, рН 6,5, из расчета, что для промывки 1 г полученного биокатализатора используют 400 мл 0,2М фосфатно-цитратного буфера с рН 6,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободной липазы.