Способ определения активности антитромбина ш в плазме крови Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулологии, и может быть использовано клинико-диагностическими и научно-исследовательскими лабораториями при диагностике нарушений гемостаза.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается путем регистрации образования сгустка фибрина в стандартной смеси тромбина с фибриногеном (контрольная проба), а также 8 такой же смеси с добавлением исследуемой плазмы (опытная проба) с помощью тромбоэластографа одновременно в двух пробах на параллельных каналах. При сопоставлении графической записи контрольной и опытной проб рассчитывается активность антитромбина III по хронометрическим и структурным параметрам графической записи.

Способ осуществляют следующим образом.

Исследуемую кровь отбирают из вены и смешивают со стабилизатором в обычном соотношении. Затем из нее путем центрифугирования осаждают тромбоциты. Обедненную тромбоцитами плазму дефибринируют. Дефибрини.рование производят нагреванием в водяной бане до 56Ч.

Растворы для стандартной смеси: коммерческий раствор тромбина с акг тивностью 15-16 с(т.е. в количестве 0,2 мл, способный за 15-16 с свернуть 0,3 мл 0,%-ного раствора коммерческого фибриногена); раствор фибриногена О, в буфере Михаэлиса, рН 7,8.

Раствор тромбина инкубируют при 37 С и добавляют к нему исследуемую плазму. Затем смесь переносят в расел ьо ю

1C

Tf3op фибриногена, находящийся в кювете тромбоэластографа (температура кюветы также 37°С), Одновременно в другую кювету прибора., содержащую

такое же количество фибриногена вносят раствор тромбина - контрольная проба. Включают запись тромбоэласто- гранмы. Активность антитромбина III рассчитывают по процентному соотно- шению временных и структурных параметров тромбоэластограммы в контрольной и исследуемой пробах по формулам:

А, --i100%, где tu - время обра зова с

ния сгустка в опытной пробе t вре

мя образования сгустка в контрольной пробв А . - активность антитромбина III, характеризующая скорость инак тивации тромбина

мл йд;-1оо°. ,

макси

мальная амплитуда тромбоэластограммы в опытной пробе; МА| - максимальная амплитуда тромбоэластограммы в кон- трольнбй пробе; Аддд- активность антитромбина III, характеризующая степень инактивации тромбина.

Пример 1, Используемые реактивы: раствор .цитрата натрия, Буфер Михаэлиса рН 7,В, Приготавливают из- смеси двух растворов. А. 20,6 г диэтилбарбитурата натрия растворяют в дистиллированной воде, доводят объем раствора до 1 литра, Б. 0,1 М р-р НС1. Смешивают.331 мл раствора Аи И9 раствора Б. Добавляют 7,07 г Nad, Доводят объём б.уферного раствора до 1 л дистиллированной водой.

Раствор тромбина в буфере Михаэлиса (0,2 ш раствора должны свертывать 0,3 0,%-ного раствора фибриногена, за 15-16 с).

Раствор фибриногена.в буфере Михаэлиса .

Приготовление исследуемой дефиб- ринированной плазмы.

Из вены здорового донорй силико- нированной иглой берут кровь, (первые 0,5 мл сливают) и смешивают ее в пластмассовой пробирке с 3, раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин. Отсасывают богатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют при 000 об/мин 20 мин. Отсасывают бедную тромбоцитами плазму и прогревают ее на водяной бане

Q

с

0

0

5

5

45

50

55

при 56°С (этот параметр должен строго соблюдаться) 5 мин. Центрифугиру- ют 10 мин при 4000 об/мин. Надосадоч- ный слой плазмы отсасывают.

Таким образом, плазму получают у 10 здоровых доноров, смешивают.в равных объемах в одной пробирке и берут смесь для проведения исследования на точность воспроизводимости метода. В целliной смеси плазм активность ан титромбина III по способу-прототипу условно приниг-1ают за 100.

Ход определения, В пластмассовую пробирку набирают 0,8 wi раствора тромбина, прогревают в водяной бане при 37°С 2 мин и добавляют к нему 0,2 мл исследуемой плазмы. Инкубируют при 37 С 3 мин (опытная проба),

В две кюветы тромбоэластографа на параллельные каналы вносят по 0,3 мл р-ра фибриногена (при 37°G в кюветах) и прогревают 1 мин. После этого в одну кювету вносят прогретую смесь тромбина и исследуемой плазмы - опытная проба, в другую кювету - 0,8 мл раствора тромбина (в течение 2 мин прогретого при 37 С) - контрольная проба. Сразу включают запись тромбоэластограммы,-. .

Полученные тромбоэластограммы опытной и контр ольной проб измеряют по с Ледующим параметрам: параметр t(MM)- время от начала записи до расхождения краев тромбоэластограммы на 1 мм - начало образования сгустка фибринаj параметр МА - максимальная амплитуда - расстояние между краями тромбоэластограммы (мм), В этот момент сгусток обладает максимальной плотностью.

Расчет показателей тромбоэласто- грамм,

В первом случае и опытной пробе мм, .в контрольной пробе мм. Активность антитромбина III, характеризующая скорость инактивации тромбина, определяется так:

А, -100% 7- 100% 350%, t t k4

Во втором случае в опытной пробе НА о 5 мм, в контрольной МА 15 мм,

Активность антитромбина III, характеризующая степень инактивации тромбина, определяется:

А., 33%

м МА,

15

Для выяснения степени точности предлагаемого метода определения активности антитромбина III в этой смеси плазму повторяли в 10 пробах (табл. 1).

Анализ активности антитромбина III по способу-прототипу также проводился в 10 пробах этой смеси (табл.2), Величина квадратичного отклонения (б) ряда определений по способу-прототипу значительно больше и равна t9,32. По заявленному способу определения ,35 и ±0,67. Ошибка метода д- ЮО по способу-прототипу также значительно выше и равна по заявляемому способу - 2,8% и Ц%,

Пример 2. Используемые реактивы.

3, раствор цитрата натрия.

Буфер Михаэлиса рН 7,8 (Приготав ливают из смеси двух растворов: А. 20,6 г диэтилбарбитурата натрия растворяют в дистиллированной воде, доводят объем раствора до 1 литраj Б. 0,1 М р-р НС1. Смешивают 331 мл рас- т вора Аи мл раствора Б. Добавляют 7,07 r.NaCl. Доводят объем буферного раствора до 1 л дистиллированной водой).

Раствор тромбина в буфере Михаэлиса (0,2 МП раствора должны свертывать 0,3 Мл О, t раствора фибриногена за 15-16. сек), : Раствор фибриногена в буфере Михаэлиса 0,.

I Приготовление исследуемой дефиб- ринированной плазмы.

Из вены здорового донора силико- нированной иглой берут кровь (первый 0,5 мл сливают) и смешивают ее в пластмассовой пробирке с 3,8% раствором цитрата натрия.в соотношении 9г1. Центрифугируют при 1500 об/мин , Отсасывают богатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют при kOQQ об/мин 20 мин. Отсасывают бедную тромбоцитами плазму и прогревают ее на водяной бане при 5б°С (этот параметр должен строго соблюдаться) в течение 5 мин. Центрифугируют si О мин при ЛООО об/мин,надосадочный слой плазмы отсасывают.

Затем плазму, полученную от 10 здоровых доноров, смешивают в равных объемах в одной пробирке. Полученную смесь разводят физиологическим раствором в соотношении 1i1. Активность антитромбина-Ш по способу-прототипу в этой смеси принимается за 50%.

s

0 5

о

Q

i

5

0

5

Ход определения. В пластмассовую пробирку набирают 0,8 мл раствора тромбина, прогревают в водяной бане при 37°С 2 мин и добавляют к нему 0,2 мл исследуемой плазмы. Инкубируют при 37°С 3 мин (опытная проба).

В две кюветы тромбоэластографа на параллельные каналы вносят по 0,3 мл р-ра фибриногена (при т-ре в кюветах) и прогревают 1 мин. После этого в одну кювету вносят прО гретую смесь тромбина и исследуемой плазмы - опытная проба, в другую кювету - 0,8 мл раствора тромбина (прогретого в течение 2 мин при 37°С) - контрольная проба. Сразу включают запись тромбоэластографа.

i

Полученные тромбоэластограммы опытной и контрольной проб измеряют по следующим параметрам: 1) параметр t (в мм) - время от начала записи до расхождения краев тромбоэластограммы на 1 мм - начало образования сгустка фибрина i 2) пара метр МА - максимальная амплитуда - расстояние между краями тромбоэластограммы (в мм). В этот момент сгусток обладает максимальной плотностью.

Расчет показателей тромбоэласто- грамм.. В опытной пробе tp 10 мм. В контрольной пробе t k мм.

А -jjj-OOO% 250% (активность

антитромбина-111, характеризующая скорость инактивации тромбина).

4

В опытной пробе МАо 8 мм. В контрольной пробе МА 15 мм.

о -100% 60% (активность

антитромбина - III, характеризующая степень инактивации тромбина).

Для выяснения достоверности ряда было проведено определение активности антитромбина-111 в 10 пробах разведения смеси плазм доноров по заявленному способу и способу-прототипу (табл. 1 и 2).

Среднее квадратичное отклонение ряда заявляемого способа значительно меньше, чем способа-прототипа (tO,68 и ±0,65 против ±5,) .

Ошибка метода также значительно меньше при использовании заявленного способа .(2,3% и 2, против А,9% при использовании способа-прототипа)„

формула изобретения Способ определения активности антитромбина III в плазме крови путем инкубации тромбина с дефибринирован- ной, бедной тромбоцитами, стабилизированной плазмой, добавления полученной смеси к фибриногену с последующей инкубацией и определением времени образования сгустка, о т л и .ч а- ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, инкубацию проводят в кюветах тромбоэласто- графа, при этом одновременно инкубируют пробу, содержащую фибриноген с тромбином, в обеих пробах опре™ деляют время образования сгустка, его плотность и по разнице указанных показателей в первой и второй пробах рассчитывают активность антитромбина III в процентах.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для изучения патологии системы гемостаза. Цель - повышение точности способа. Проводят сопоставление графической записи на тромбоэластографе процесса образования сгустка фибрина в контрольной смеси тромбина с фибриногеном и в опытной пробе такой же смеси с добавлением исследуемой плазмы. Расчет полученной записи тромбоэластограмм проводят по двум параметрам - хронометрическому и структурному.

Т а б л и ц а Определение активности антитромбина-III по предлагаемому способу

Сред- 1 510

няя +0,11 ±0,22 ±0,23

М±м.

% от 350% 33 250 кон- t9,60 t1,30 t5,76 тро- лп

Ошибка

определения

,8 i4%2,3%

,35 ±0,67 to,68

Р 0,,001 iO,001

9 7 125 15

to,21±0,2±0,21 ±0,22±0,21tO,21±0,2

66 100

t1,,2tl, i2±it,95t,

2,k7% 2,9 1,78 t,1 1,52 5,25 1,33 to,65 ±0,67 ±0,68 ±0,68 iO,65 to,67 tO,66 0,001 0,001 0,001 CO,01 0,01

Таблица 2 Определение активности антитромбина-III по способу-прототипу

№ п/п

Разведения плазмы

100% 50% 25%

Время образования сгустка, с

68 65 65 50 68 66 55 fjO it9

59t2,95

t2 32 35 32 31 33 31 З 31

35t1,72

5%

15 16 2k 32 21 15 22

33 28 22

2311,92