Способ определения антигепариновой активности тромбоцитов Советский патент 1992 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к коагулогии, и может быть использовано для лабораторной диагностики врожденных и приобретенных нарушений функции тромбоцитов, для выявления 4 тромбоцитарного фактора (4ТФ) внутрисо- судистого свертывания крови и тромбообра- зования.

Известен способ определения 4ТФ и антигепариновой активности (АГА) тромбоцитов, основанный на учете действия прогретой, бедной тромбоцитами плазмы крови, содержащей то или иное количество термостабильного 4ТФ, на тромбин-гепариновое время свертывания донорской бедной тромбоцитами плазмы, являющейся источником фибриногена и антитромбина- III. Степень укорочения тромбин-гепаринового времени свертывания служит мерилом активности 4ТФ Разницу определяют в секундах, она составляет от 0 до 5 с, в среднем 2,4 + 0,3 с. Аналогичное исследование проводится в плазме полученной после АДФ-агрегации При нормальной функциональной способности тромбоцитов разница составляет больше чем 5 с, а при тромбоци- топатиях эта разница отсутствует или слабо выражена (Лаб дело, 1974, № 12, с 720).

Известный способ требует тестирования двух нестойких реактивов - тромбина и гепарина; недостаточно точная их подгонка указана самим автором, как основная причина ошибок метода С целью контроля в способе-прототипе используется донорская плазма с возможными у различных доноров колебаниями уровней фибриногена и анти- тромбина-lll Кроме того, в плазме доноров присутствуют ингибиторы гепарина, которые, несомненно, могут искажать результаты, а выражение активности 4ТФ и АГА в секундах не позволяет судить о конкретных цифрах нейтрализованного гепарина

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа.

Поставленная цель достигается гем, что определяют содержание гепарина до и после АДФ-агрегации тромбоцитов и по его

СО

2

Ю О

разнице судят об АГА тромбоцитов и активности 4ТФ.

Использование предлагаемого способа позволяет упростить определение АГА тромбоцитов, так как не требуется многосту- пенчатое тестирование нестабильного по своей активности гепарина, а используется стандартный раствор фибриногена вместо субстратной донорской плйзмы с непостоянным содержанием фибриногена, анти- тромбина-Ill, с наличием ингибиторов гепарина в ней, что существенно влияет на воспроизводимость способа-прототипа и, как следствие, делает необходимым проведение повторных исследований крови у тех же лиц с целью верификации полученных результатов. Указанных недостатков лишен предлагаемый способ, который, помимо всего, позволяет выразить активность 4ТФ в конкретных цифрах нейтрализуемого им гепарина.

Способ осуществляют следующим образом.

У обследуемого силиконированной иглой берут кровь и смешивают ее в силикони- рованной пробирке с 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, затем центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Отбирают богатую тромбоцитами плазму и делят ее на две порции. В одной порции, богатой тромбоцитами, плазмы определяют АДФ-агрегацию тромбоцитов. После этого исследование обеих порций плазмы проводят параллельно. Богатую тромбоцитами плазму центрифугируют в пластиковых пробирках при 4000 об/мин в течение 20 мин. Берут бедную тромбоцитами плазму и прогревают на водяной бане при 56°С в течение 5 мин. После тепловой дефибринации осаждают фибриноген центрифугированием в течение 10 минут при 4000 об/мин. Надосадочный слой снимают для проведения исследования.

В силиконированную пробирку набирают 0,4 мл рабочего раствора тромбина (активностью 13 с на стандартном растворе фибриногена в 0,4% буфере Михаэлиса), Рабочий раствор тромбина прогревают на водяной бане при 37°С в течение 2 минут и добавляют к нему 0,2 мл исследуемой де- фибринированной плазмы. Сразу включают секундомер. Через 3 мин инкубации этой смеси при 37°С 0,1 мл ее переносят в пробирку с 0,3 мл раствора фибриногена и регистрируют время свертывания. По калибровочной кривой находят процентное содержание антитромбина-lll.

Во вторую пробирку перед инкубацией при 37°С к 0,1 мл дефибринированной плазмы добавляют 0,15 мл 0,1%-ного раствора протаминсульфата. Во второй пробе определяют процентное содержание антитромбина-lll по вышеприведенной методике (Trombos.-diathes Haemost., 1974, v.24, № 1 - 2, pp.224 - 229). Вычисляют разность между показателями первой и второй проб. По калибровочной кривой находят содержание гепарина в ед/мл плазмы, соответствующее разнице активности двух проб.

Определение содержания гепарина в плазме, полученной после АДФ-агрегации, проводят по методу (А.С. СССР Ns 1448890, 01.09.88).

Далее до разности в содержании гепарина до агрегации тромбоцитов и после нее судят об АГА тромбоцитов или активности 4ТФ, выражаемой в ЕД нейтрализованного гепарина/мл плазмы.

П р и м е р 1. Б-ная С,, 9 лет, поступила впервые для обследования. С 8 лет отмечаются носовые кровотечения, экхимозы на туловище и конечностях. Рутинная клиническая коагулограмма нарушений не выявила. Затем была обследована в лаборатории гемостаза.

Результаты;

-количество

тромбоцитов212 тысяч

-адгезия тромбоцитов50%-АДФ-агрегация75%

-содержание

гепарина0,08 ЕД/мл плазмы

-содержание гепарина после

АДФ-агрегации 0,079 ЕД/мл плазмы

-активность 4ТФ 0,001 ЕД/мл плазмы.

Предлагаемый способ позволили диагностировать тромбоцитопатию с нарушением секреции из тромбоцитов 4ТФ.

П р и м е р 2. Б-ная И., 5 лет, поступила в клинику с жалобами на частые носовые кровотечения, спонтанные. В семье аналогичной кровоточивостью страдает мать девочки.

Изобретение относится к медицине, а именно к коагулогии, и может быть использовано для лабораторной диагностики нару- шения функций тромбоцитов. Цель - повышение чувствительности и упрощение способа. Сущность изобретения: определяют содержание гепарина в пробе до и после АДФ-агрегации тромбоцитов и по разности в содержании гепарина судят об антигепариновой активности тромбоцитов. Положи- тельный эффект: при использовании изобретения позволит повысить чувствительность на 30%.

Результаты обследования:

-количество тромбоцитов

-адгезия тромбоцитов

-АДФ-агрегация

-содержание гепарина

мать

304 тыс.

34%

84%

О.С9 ЕД/мл плазмы

0,09 ЕД/мл плазмы 0,01 ЕД/мл плазмы

Диагноз: наследственная тромбоцитопатия с нарушением АГА тромбоцитов и секреции 4ТФ.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа удалось не только расшифро- вать генез кровоточиЕости, но и установить его наследственный характер, что имеет значение для эффективной диспансеризации больных с нарушениями тромбоцитар- ного звена гемостаза.

ПримерЗ. Б-ная П., 7 лет. Диагноз: Геморрагический иммунный микротромбо- васкулит, кожно-суставно-абдоминальная форма. В клинической картине - типичный васкулитно-пурпурный тип кровоточивости с поражением суставов, с абдоминальным синдромом.

Лабораторные данные:

-количество тромбоцитов330 тысяч

-адгезия тромбоцитов37%

-АДФ-агрегация147%

-аутокоагуляционный

тест на 10 мин.108%

-этаноловый тест +++

-суммарная фибри- нолитическая активность крови20%

-неферментативная фибринолитическая

активность крови4%

-содержание гепарина 0,1 ЕД/мл

плазмы

-содержание гепарина после АДФ-агрегации 0,01 ЕД/мл

плазмы

-активность 4ТФ0,09 ЕД/мл

плазмы

Таким образом, по лабораторным данным, выявлены гиперагрегация тромбоцитов, гиперкоагуляция, наличие в плазме крови растворимых фибрин-мономерных комплексов, выраженное угнете0,073 ЕД/мл плазмы 0,017 ЕД/мл плазмы

ние неферментативной фибринолитической активности крови, ассоциирующееся с повышенным уровнем активности 4ТФ (антигепаринового). При этом уровень гепарина в плазме крови снижен.

Больной проведена базисная терапия гепарином с дотацией антитромбина-lll в виде трансфузий свежезамороженной плазмы, при этом активность 4ТФ нормализовалась, с восстановлением до нормальных величин других показателей коагулограм- мы.

В данном случае предлагаемый способ позволил эффективно оценить антигепариновую активность плазмы крови, что способствовало проведению адекватной антикоагулянтной терапии.

Клинические примеры подтверждают чувствительность предлагаемого способа, который позволяет осуществить лабораторную диагностику врожденных и приобретенных нарушений функции тромбоцитов и выявить феномен внутрисосудистого свертывания крови и гиперкоагуляции.

Метод легко воспроизводим в клинических условиях, требует значительно меньше времени на его проведение по сравнению со способом-прототипом.

Результаты исследования приведены в таблице.

Формула изобретения Способ определения антигепариновой активности тромбоцитов, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы, проведение АДФ-агрегации тромбоцитов с последующим получением бес- тромбоцитарной цитратной плазмы, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, определяют содержание гепарина в пробе до и после АДФ-агрегации тромбоцитов и по разности в содержании гепарина судят об антигепариновой активности тромбоцитов.