Способ очистки человеческого @ -интерферона Советский патент 1989 года по МПК A61K38/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к способу очистки человеческого интерферона, особенно человеческого (5-интерферона.

Цель изобретения - повышение производительности процесса.

Способ осуществляют следующим образом.

Сырой интерферон, полученный в результате деятельности клеток человека, обрабатывают обездвиженным синим носителем, ИнтерЛерон, поглощенный на обездвиженном синем носителе, элюируют элюентом. Затем отбираемый раствор интерферона обрабатывают хелат- металлическим носителем с остатком хелатирования, включаюш5 м по меньшей мере ион одного металла, выбранный

14 24из группы, состоящей из Со , Ni и Zn . Интерферон, поглощенный на хе- латметаллическом носителе, отделяют от носителя, получая препарат интерферона большой чистоты и высокой Кон- центрации.

Раствор сырого интерферона сначала приводят в контакт с обездвиженным синим носителем, .

Синий краситель можно обездвиживать на любом из разнообразных обычно йс- пользуемых носителей, способном соединяться с красителем. В число таких носителей входят (А) соединение красителя через амино-группу антрахи1юно- вой части с агарозой, активированной бромистым цианом; (в) соединение красителя с гелем поперечно связанной агарозы способом триазинового соединения через эфирную связь; (с) соединение синего декстрана R (декстран, соединенный с синим красителем, фирма Фармесиэ) с агарозой, активированной бромистым цианом методом триазинового соединения; (д) соединение синего красителя, связанного с

сд to

со

о

4

О

СМ

315

боковой цепью Аффиа-геля 10® Кфирмы Био-Рад лэб. именуемой ниже Вио-Рад ) через пептидную связь с полисахаридным носителем. Можно также использовать другие носители, например поперечно связанный дёкстрано- вый гель, например Сефадекс , (фирма Фармесиэ), и виниловый полимер с гидроксильными группами, который также можно использовать как носитель дпя для хелатметаллической хроматог- раЛии в следующей стадии, предпочтителен гидрофшп Ш;,1Й гранулированный полимер, например, Тойопёрл,; (фирма Тойо сода комп.).

Предпочтительно использовать синий агарозовый гель, соответствующий. I;B), так как он весьма эффективно связывается с интерфероном, не вызывает отделения красителя от носителя, поскольку соединение красителя с носителем является весьма стабильным в условиях рН от 6 до 13, и он легко доступен на рынке. Этот синий агарозо вый гель имеет следующую структуру и реализуется под товарным наименованием сефароз СЪ-бв {фирма Фармесиэ) Матрекс гель блу А® (фирма Амикон корп .) и Аффи-гель блу® (фирма Вио-Рад)

О NH-i

SOaH .,.,

TSIH N. /

t NH4ON Поперечно свN . занный агаро80зН О вый

гель

Для контактирования обездвиженного синего носителя с раствором сырого интерферона можно использовать либо порционный метод, либо колонный способ.

Пример 1. Раствор сырого интерферона бып получен путем обработки человеческих фибробластовых клеток в среде MEM Игла, содержавшей 0,4% метилцеллюлозы с поли 1; поли С, с последующей обработкой цикло- гексимидом и актиномипином Д,

К 30 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 6,2 и10 имфедо бьшо добавлено 21 мг белка и 100 мкг, актиномицина Д на 1 л 30 мл геля синей агарозы (Аффи- гель блу® фирмы Вио-Рад). После перемешивания в течение 40 ч и вы-

держивания в течение 3 ч надосадоч- ная жидкость была извлечена, и гель агарозы был перенесен в колонну, с промывкой физиологическим раствором, содержащим фосфатнокислотный буфер Надосадочная жидкость была извлечена снова. Колонну дважды промывали и элюировапио Использовали следую щие промывочные растворы и элюент:

первый промывочный раствор (320 мл):

раствор 1,0 М хлористого натрия, содержащий 10 мМ фосфор- . нокислого натрия fpH 7,2) второй промывочный раствор (280 мл):

25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2) элюент (400 мл):

55%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1,0 М хлористого натрия (рН 7,2)о

Получен выход частично очищенного интерферона в элюате(300 мл) 81% от исходного раствора интерферона, очищение в 33 раза.

В колонну с хелатом цинка (10 мп) элюат (285 мл) и колонны геля синей агарозы пропустили при скорости потока 20 мл/г„ После двойной промывки колонну элюировалио Использовали следующие промывочные растворы и элюент:

первый промывочный раствор (300 мл):

дистиллированную воду и О,Г М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/г в течение 1 ч поочередно

второй промывочный раствор (50 мл)г 20 мМ раствор лимоннокислого натрия (рН 5,0) элюент;

0,1М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий (рН 4,5).

Выкод хелатцинковой хроматографии 87%, а общий выход 70%„ Достигнута очистка э 330 раз.

Активность и выход интерферона, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табл.1,

Анализ активности интерферона посредством электрофореза полиакриламид ного геля о

Часть конечного элюа та подвергли диализу в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) и лиофилировалио Поле восстановления лиофилированного диализата 2-меркаптоэтанолом восстановленный материал подвергли электрофорезу с использованием полиакрил- амидного геля в присутствии НДС согласно способу Лэмпи (Нейчэр, 227, 680-635 (1970)) для проведения аналза активности интерферона и красителя с о о.. 00 а блестящей синью R 200. В результате активность интерферона и теммо-синяя полоса были обнаружены только в положении, соответствовавшем молекулярному весу примерно 23000 о

Анализ актиномицина Д„

Анализ актиномицина Д был проведен способом биологической пробы

Часть конечного элюата обессолили путем гель-хроматографии, используя Сефадекс G 25® после добавления сывроточного альбумина человека (1 мг/мл). Добавляя дополнительно небольшое количество сывороточного альбумина человека и лактозы обессоленный злюат профильтровали через фильтр 2 мкм и лиофилировали, Акти- номицин Д был обнаружен в количестве не больше 0,0003 мкг/10 иМаед активности интерферона,

Элюат из колонны геля синей агаро зы содержал; 0,7 мкг/м актиномицина До Общее количество актиномицина Д составило 210 мкг. Кроме того, присутствие актиномицина Д в элюате из колонны геля синей агарозы было обнаружено по поглощению (430 нм) и путем биопробыо

Часть элюата из колонны геля синей агарозы обессолили способом гель хроматографии с использованием Сефадекс G-25® после добавления человеческого сывороточного альбумина. Удаляя этиленгликоль, обессоленный элюат лиофилировали. Все же было обнаружено около 0,7 мкг/10 имоедо интерферонной активности актиномици- на Д.

Пирогенное испытание на кроликах

Полученный указанным выше способом из конечного элюата лиофилирован ный материал инъектировали внутривенно трем кроликам ( иМоед./кг

массы кроликаJ, Суммирование пирек- сии для всех трех кроликов было 0,6 С. Интерферон, очищенный по предлагаемому способу, оказался отрицательным к пирогенному испытанию на кроликахо

Лиофилированный материал, полученный из элюата колонны геля синей агарозы, инъектировали внутривенно

трем кроликам ( ед/кг массы

кролика/о Суммирование пирексии для

всех трех кроликов было 1,5 С, Интерферон, очищенный согласно способу хроматографии синей агарозы, оказался неопределенно отрицательным к пирогенному испытанию на кроликах

Пример 2. В этом эксперименте использовали раствор сырого интер- ферона, подобный использовавшемуся в примере 1.

20 л раствора сырого интерферона пропустили через колонну синей агарозы объемом 20 мл (Матрекс гель блу А® , фирмы .Амикон корп). Колонну трижды промыли и элюировалио Использовали следующие промывочные растворы и элюент:

первый промывочный раствор (200 мл):

1 М хлористый натрий, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2). второй промывочный раствор (200 мл):

25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7,2). третий промывочный раствор (40 мл);

40%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хл&ристого натрия (рН 7,2). элюент (200 мл):

55%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого нат- рия о

Хелатцинковую колонну (5 мл) соединили с выходом колонны синей агарозы после начала элюирования, и элюат из колонны синей агарозы непосред- ственно пропускали через хелатцинко- вую колоннуо Затем хелатцинковую колонну дважды промыли и элюировалн Промыв очные растворы и элюент были следующими:

первый промывочный раствор (200 мл);

дистиллированная вода и 0,1 М фосфорнокислого натрия (рН 6,7) поочередно второй промывочный раствор (20 мл)

.20 мМ лимоннокислый натрий (рН 5,0): элюент:

0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый на грий, содержащий 1 М хлористого натрия.

Интерферонная активность, выход, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в табло2,

П р и М е р 3, 20 л раствора сырого интерферона с интерферонной активностью 15-10 им, едо и 60 мг/л общего белка контактировали с ДО мл синеагарозного носителя (Матрекс гель Блу А® фирмы Амикон корПо). Носитель, на который был адсорбирован интерферон, загрузили на колонну. Затем колонну дважда промыли и элюировалио Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (400 мл):

раствор хлористого натрия 1 М, .содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2)о второй промывочный раствор (400 мл):

25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 10 мМ фосфорнокислого натрия и 1 М хлористого натрия (рН 7,2)а элюент;(400 мл).

100 Mrt раствора интерферона, отобранного из колонны синей агарозы, пропустили через 5 мл хелатникелевую колонну. Использованная колонна хелата никеля была.приготовлена так же, как в примере 1, за исключением того, что вместо раствора хлористого цинка использовали раствор хлористого никеля Хелатникелевую колонну промьши и элюировали. Использовали следующие промывочный раствор и элюент: промывочный раствор

дистиллированная вода и 0,1 М фосфорнокислого натрия (рН 6,7 использовали поочередно элюент:

0,2 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

натрий, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4,5). Интерферонная активность, выход, количество белка и удельная активность каждой стадии показаны в ,

Конечный элюат содержал весьма малое количество пирогенных веществ и был отрицательным относительно испытания Лимулуса, В нем не было обнаружено актиномицина Д.

Пример 4, Была повторена процедура примера 3 за тем исключением, что хелаткобальтовую колонну использовали вместо хелатникелевой колонны, причем хелаткобальтовую ко-, лонну приготовили как в примере 1, Но вместо хлористого цинка использовали раствор хлористого кобальта,

Элюат (15 мл) содержал 4,5-10 им„ едо.интерферона выход 60%) и 0,25 мг белка Удельная активность составляла 1,8-10 им„ едо/мг белка, Конеч- ньй элюат был отрицательным к испытанию Лимулуса, В нем не бьшо обнаружено актиномицина Д.

П р и М е р 5с Культивировали . штамм Е. коли, в котором бьш интегрирован структурный ген ft-интерферона, и культивированный штамм.подвергли процедурам сбора бактерий, измельчения бактерий, удаления нуклеиновой кислоты и осаждения сульфатом аммоний. Белковую фракцию, содержащую |Э-интерферон, .полученный из штамма Е.КОЛИ, растворили в 25%-ном растворе этиленгликоля, содержащем 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2), с целью получения раствора сырого интерферона. Раствор сырого интерферона имел интерферон-, ную активность 5«10 им,ед. и 20 мг белка на 1 мло

40 мл раствора сырого интерферона пропустили через колонну 2 мл синей агарозы (Матрекс .гель блу А фирмы Амикон корп.) уравновешенную буферным раствором фосфорнокислого натрия, содержащим 1 М хлористого натрия о Колонну дважды промьши с целью удаления примерно 95% белка в растворе сырого интерферона, и элюировали с фракционированием в каждую фракцию 2 мл. Использовали следующие промывочные растворы и элюент:

первый промывочный раствор (10 мп): 25%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого натл®

рия и 10 мМ фосфорнокислого нат рия

второй промывочный раствор (10 мл) 40%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого натрия элюент:

60%-ный раствор этиленгликоля, содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого натрия

Элюат (12 мл) из колонны синей ага розы имел интерферонную активность 1,6-10 им.едо (выход 80%) и 4,6 мг бвлкао Средняя удельная активность в каждой фракции была 2,5-10 иМоед„/мг белка (максо ; 510 им.еДо/мг белка).

Элюат подвергли анализу так же, как в примере 1. В результате чистота интерферонной активности при молекулярном весе примерно 19000 составляла 10-50% (средняя 25%).

6 МП элюата из колонны синей агаро зы пропустили через 1 мп хелатцинко- вой колонны, уравновешенной 60%-ным раствором этиленгликоля, содержащим 1 М хлористого натрия и 1 мМ фосфорнокислого натрия о Колонну трижды промыли и элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент: первый промывочный раствор (6 мл): 60%-ный раствор этиленгликоля , содержащий 1 М хлористого натрия и 10 мМ фосфорнокислого натрия . второй промывочный раствор (6 мл):

дистиллированная вода третий промывочный раствор (6 мл): 220 мМ буферный раствор фосфорнокислого натрия, содержащий .2 М хлористого натрия (рН 6,0), элюент:

0,1 М буферный раствор уксуснокислого натрия, содержащий 1 М хлористого натрия (рН 4,0). Конечный элюат (4 мп) имел интерферонную активность 4,0-10 имоед, (выход 50%) и 0,4 мг белка. Удельная активность была 1-10 имо едо/мг белка.

Конечный элюат подвергли анализу как и в примере 1 и обнаружили одну полосу в положении молекулярного веса примерно 19000. Чистота была больще 97%.

Пример 6. Была повторена про-, цедура примера 3, за тем исключением,

10

5

0

5

0

5

0

5

0

5

что вместо хелатникелевой колонны использовали хелатцинковую колонну и в качестве элюента использовали 0,2 М раствор Ij-гистидин, - уравновешенный хлористый натрием (рН 7,0).

Элюат (20 мп) .имел 50-10 имовд интерферона (выход 67%) и 50 г общего белка. Удельная активность была 1,0-10 им.ед./мг белка„

Пр и М-е р 7. Использовали сырой, интерферон, полученный из-человеческих фибробластовых клеток, аналогичный интерферону, использованному в примере 1.

К 20 л раствора сырого интерферона с активностью интерферона 4210 иМоед. и концентрацией бё.пка -70 мг/л добавили 30 МП геля синей агарозы CMatrex Gel Blue А® Amicon corp) После перемешивания смеси в течение 3 сут и выдержки в течение ч удалили надосадочный слой и гель синей агарозы пропустили через колонну, промывая 200 мп 1,0 М раствора хлористого натрия, содержащего 10 мМ фосфата натрия с рН 7,2 (буфер А).

Затем колонну дважды промылио Перед элюированием интерферона для улучшения очистки к выходз вьшеука- занной колонки подсоединили колонку. с 15 мл свежего геля агарозы, уравновешенного буфером А, содержащим 25%-ный раствор этиленгликоляо После третьей промывки интерферон элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элюент:

первый промывочный раствор (200 мп) буфер А

второй промывочный раствор (ЗОО нл); буфер А, содержащий 25%-раствор этиленгликоля,

третий промывочный раствор (120 мл), 3 М раствор хлористого натрия, содержащий 30 мМ фосфорнокиело- го натрия (рН 7,2) и 30%-11ЫЙ раствор этиленгликоляу

элюент (600 мп):

буфер А, содержащий 55%-ный раствор этиленгликоляо

Раствор элюата фракциониривалио Результаты представлены в табЛо4о

Фракцию второго элюирования подвергли дальнейшей очистке с помощью хелатцинковой хроматографии.

В колонну с хелатом цинка (15 мл) ввели буфер А, содержащий 50%-ньгй

ч152304

раствор этиленгликоля. Часть (270 мл) фракции второго элюирования из вышеуказанной колонны синей агарозы развели 27 мл буфера А до получения 50%-ного раствора этиленгликоля и пропустили через колонну с хелатом цинка при скорости потока 30 мл/ч.

темпеВсе операции проводили при

ратуре 2-8°С. После двойной промывки

10

10

колонну элюировали. Использовали следующие промывочные растворы и элю- ент:

первый промывочный раствор (200 мл) , дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфорнокислогонатрия (рН 6,7) использовали при скорости потока 30 мл/ч в течение 1 ч поочередно

Интерферон из элюата, содержащего 40%-ный раствор этиленгликоля, из Которой колонны геля синей агарозы подвергли.такому же анализу, как в примере 7, для определения его чисто- ты и проведения пирогенного испытания.

Чистота его была 60% и результат испытания Лумулуса положительный.

Сравнительный пример 2. Колонну

второй промывочный раствор (30 мл):2о из хелата цинка (50 мл) уравновеши2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 мМ фосфорнокислог- го натрия (рН )

элюент

0,1 М уксусной кислоты - уксуснокислого натрия буферный раствор, содержащий 0,1 М хлористого натрия (рН 7,4). Активность, выход интерферона, количество/ белка и уде 1ьная активность этой процедуры очистки представлены в табл.5.

Интерферон из колонны с хелатом цинка подвергли анализу посредством электрофореза поли акрил амидного геля ... в присутствии додецилсульфата натрия (НДС) дпя определения чистоты Элюат подвергли пирогенному испытанию с помощью теста Лимулуса, используя обнаруживающий эндотоксин реагент. Чистота интерферона 90%, элюат отрицательный к испытанию., Лимулуса при содержании интерферона 1,6-10 им ед./мпо

Сравнительный пример .1. Во вторую колонну геля агарозы (Matrex Gel Blue А®4 мп) загрузили 2 М раствор хлористого натрия, содержащий 20 мМ фосфорнокислого натрия, рН 7,2 (буфер в).

Часть ;;р...кдии (45 мп) второго элюирования ич Kb. -oH;ibi геля синей агарозы, .описаь Юй в примере /, разбавили

25

30

35

вали при помощи PBS. Неочищенньш интерферон фибробласта человека, который имел активность интерферона 30 «10 ме/мл и концентрацию протеина 70 мг/л, пропускали через колонну хелата цинка с объемной скоростью 100 МП/ч. После промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочные раствор и элюент{

промывочный раствор (400 мл), дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфата натрия (рН 6,7) использовали с объемной скоростью 100 мл/ч в течение 1 ч, с чередованием элюент:

0,1 М буферный раствор уксусной кислоты т ацетата натрия, содержащий 1,0 М хлорида натрия (рН 4,7), Фракцию элюирования на колонне хелата цинка использовали для последующей очистки при помощи хроматог- 45 рафии на голубом агаре.

Колонну из голубого агара (5 мл) уравновешивали 0,1 М буфером уксусной кислоты - ацетата натрия, содер- CQ жащим 1,0 М хлорида натрия. Фракцию элюирования из вышеупомянутой колонны хелата цинка пропускали через колонну, с голубым а:гаром с объемной скоростью 10 мл/ч. После двухкрат40

5 мл буфера А и 75 мл буфера В и про- ее ой промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочный раствор и элюант:, первый промывочный раствор (50 мл) 1,0 М раствор хлорида натрия.

пустили через вторую колонну геля синей агарозы при скорости потока 20 МП/ч. Все операции проводили при 15-25 С.

12

Буфер, содержащий 30, ДО и 50%- ный раствор этиленгликоля соответственно пропустили через колонну со скоростью потока 20 мп/Чо

Результаты второй хроматографии Геля синей агарозы представлены в табл.6.

Интерферон из элюата, содержащего 40%-ный раствор этиленгликоля, из Которой колонны геля синей агарозы подвергли.такому же анализу, как в примере 7, для определения его чисто- ты и проведения пирогенного испытания.

Чистота его была 60% и результат испытания Лумулуса положительный.

Сравнительный пример 2. Колонну

из хелата цинка (50 мл) уравновеши5

0

5

вали при помощи PBS. Неочищенньш интерферон фибробласта человека, который имел активность интерферона 30 «10 ме/мл и концентрацию протеина 70 мг/л, пропускали через колонну хелата цинка с объемной скоростью 100 МП/ч. После промывки колонну подвергали элюированию. При этом использовали следующие промывочные раствор и элюент{

промывочный раствор (400 мл), дистиллированную воду и 0,1 М раствор фосфата натрия (рН 6,7) использовали с объемной скоростью 100 мл/ч в течение 1 ч, с чередованием элюент:

0,1 М буферный раствор уксусной кислоты т ацетата натрия, содержащий 1,0 М хлорида натрия (рН 4,7), Фракцию элюирования на колонне хелата цинка использовали для последующей очистки при помощи хроматог- 5 рафии на голубом агаре.

Колонну из голубого агара (5 мл) уравновешивали 0,1 М буфером уксусной кислоты - ацетата натрия, содер- Q жащим 1,0 М хлорида натрия. Фракцию элюирования из вышеупомянутой колонны хелата цинка пропускали через колонну, с голубым а:гаром с объемной скоростью 10 мл/ч. После двухкрат0

содержащий 10 мМ фосфата натрия, рН 7,2 (буфер А), второй промывочный раствор ГЗО мл буфер А, содержащий 25% этилен- гликоля : элюант:

буфер А, содержащий 55% гликоля,

Раствор элюата подвергали фракционированию. Результаты приведены в табл.7,

Сравнительный пример 3„ В качестве исходного материала использовали неочищенный интерферон фибробласта, .который имел активность интерферона 7,7-10 ме/мл и концентрацию протеина 35 мг/л. Этот исходный раствор (2,0 л) смешивали с 5 г (17 мл) ошри ков ЦРГ (пористыми стеклянными шариками с размером пор 350 А) и смесь энергично перемешивали в течение 13 ч. Затем смесь пропускали через стеклянный фильтр и шарики ЦРГ упаковывали в колонну (диаметр 0,9 см) Далее колонну промывали 00 мл PBS, а затем 0,01 М раствором глицйна-НС1 при рН 3,5, и элюировали 0,3 М буфером глицина-НС при рН 2,0, содержащим 0,1 мг/мл альбумина сыворотки человека.

Элюаты подвергали диализу с использованием 41 л 1 М раствора ЫаС1 буферированного 0,02 М раствором фосфата (рН 7,4).

Диализированный раствор :пропуска- ли через колонну с хелатом цинка с размерами 0,6.7 см,затем колонну промы- :вали 10 мл 1 М раствора хлорида натрия, .буферированногй 0,02М раствором фосфата (рЫ 7,4) и 10 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (рН 5,9). Затем колонну элюировали 0,1 М буфером ацетата натрия (рН 4).

Полученные результаты приведены в табл.8.

Срат.1Нпте. ирпмрр. 4 Использусырпн че.иовечргки |}.лтбробластный

орфег: Н, анпло пчпмГг используемок;гни :-{у в примере

PiirTBop сырого чт 7ррфгфона, имеющего активность итгюрферона 38-10 им ед./л 5 конпентрацию белка 63 мг/л и удельную активность ) 10 ./мг белка, регулируют до рН 2 путем добавления 6 н. НС и загружают в колонку- SP-Сефадекг.а (20 мл, 2 см « Кб,4 см). После г.чгрузки 6 л раство0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

ра сырого интерферона со скоростью потока 40 МП/ч колонку промывают 2ПО мл дистиллированной воды. Затем колонку элюируют 320 мл 0,1 М буферного раствора фосфорнокислого натрия (рН 8,3). Раствор элюата фракционируют. Результаты приведены в табл,9о Вторую и третью фракции элюирова- ния используют для последующего способа очистки путем хелатцинковой хро- , матографиио

Колонну с хелатом цинка (З мл, 1 см 3,8 см) уравновешивают 0,1 М буферным раствором фосфорнокислого натрия (рН 8,3). Вышеуказанные фракции (ЗОО мл) из колонки ЗР-Сефадекса пропускают через хелатцинковую колонну со скоростью потока 6 мл/ч. После промывки дважды колонну элюируют. Используют следующие промывочный раст - вор и элюент:с

первый промывочный раствор (40 мл): дистиллированная вода и М раствор фосфорнокислого натрия (рН 6,7|, используемые пооче-; редно со скоростыо потока 6 мл/ч в течение 1 ч второй промывочный раствор (б мл): 2 М хлористый натрий, содержащий 20 мМ фосфорнокислого натрия (рН 7,2) элюент:

0,1 М буферный раствор уксусная кислота - уксуснокислый натрий. Содержащий 0,1 М хлористого натрия (рН 4,7) Результаты этого способа очистки приведены в табл.10.

Используемый в качестве исходного материала раствор сырого интерферона имеет рН 7,3о После отстаивания в те- |Чение 10 дней его интерферонная активность составляет 3810 им.ед./л и никаких изменений в активности интер- . фарона не обнаружено. Тогда как после отстаивания в течение 10 дней раствора сырого интерферона, имеющего рН 2, перед загрузкой его в колонку SP-Сефадекса, интерферонная активность снижается до 16 10 им.ед./л.- Это означает, что раствор сырого интерферона неустойчив при рН 2о

Изобретение имеет следующие существенные признаки и преимущества по сравнению с известным техническим решением.

Способ очистки в соответствии с известным техническим решением вклю

чает SP-Сефадексовую хроматографию на колонках с последующей хелатметал- лической хроматографией. Сырой интерферон, очищаемый в соответствии с известным способом , имеет низкую концентрацию, например используемый в примере 1 сырой интерферон имеет активность интерферона 3,2-10 им едс,/л и концентрацию белка 20 мг/л, а используемый в примере 2 сырой интерферон имеет активность интерферона 5-10 им.едо/л и концентрацию белка 25 мг/ло Известное техническое решение имеет в виду очистку сырого интерферона с относительно низкой концентрацией о

Предлагаемый способ очистки включает хроматографию на обездвиженном синем носителе с последующей хелат- металлической хроматографией В соответствии -с этим способом очистки Сырой интерферон с высокой концентра- {цией (например, сырой интерферон, |используемый в примере 7, имеет активность интерферона 42 10 иМоеДо/л и концентрацию белка 70 мг/л Может быть удовлетворительно очищено

Кроме того, как видно из примера 7, в котором использовали сырой интерферон с высокой концентрацией, извлечение продукта по известному способу составило самое большое 47% , Таким образом, известный способ непргоден дпя очистки сырого интерферона с высокой концентрацией Это становится более очевидным из сравнения результатов примера 7 с- результатами сравнительного примера 4 (в обоих прмерах материалом дпя очистки был сы- рой интерферон с высокой концентрацией,,

очистительстадияочистительстадия

7 69

36 20

Применение известного способа ограничивается сырым интерфероном с относительно низкой концентрацией Предлагаемый способ применим к сырому интерферону как с низкой концент0

5

0

0

5

0

35

45

5U

55

рацией, так и с высокой концентра- дией о

Известный способ имеет недостаток заключающийся в том,что перед загрузкой колонки SP-Сефадекса сырой интерферон обязательно делают сильнокислотным поскольку интерферонная активность при таком кислотном состоянии заметно теряется, как показано в сравнительном примере 4о

Этот недостаток известного способа не обнаруживается в изобретении, поскольку хроматографию на обездвиженном синем носителе осуществляют в условиях почти нейтрального рН.

ПримерЗо Используемый раствор неочищенного интерферона получают путем обравотки клеток человеческого фибробласта с использованием методики, аналогичной примеру 1,

К раствору неочищенного интерферона, который имеет активность интерферона, равную 30000 едо/л, белковую концентрацию, равную 0,11 мг/мп и рН 7,2, прибавляют 6 н„ раствор НС1 или I Но раствор NaOH с тем, чтобы довести рН до 2,3, 4,5,6,7,8,9 или 10.

Устойчивость каждого раствора неочищенного интерферона испь1тывают путем определения титра, оставшегося после отстаивания каждого раствора неочищенного интерферона при температуре в течение 16 ч.

Ниже приведены результаты испытания, выраженньш в процентном содержании

рНУстоЙ11ивость,%

283

369

480

590

697

7100

898

994

1080

Затем 15 мл каждого раствора неочищенного интерферона помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку, в которую также помещают 0,05 мл синего красителя в качестве носителя (Matrex Gel Blue/Р)и смесь перемешивают при в течение 16 ч. После удаления надосадочного слоя и промывания дважды 2,5 мл 10 гМ раствора фосфат натрия - 1 Но NaCl (рН 7,2) 2 мл

10 мМ.фосфата натрия - 1 н NaCl (рН 7,2), содержащего 55%-ный этилен .гликоль, прибавляют к носителю После центрифугирования удаляют надоса- дочный слой, содержащий частично очищенный интерфероно

Затем определяют коли.чества потерянного интерферона Гобщее содержание интерферона, не абсорбированного на носителе, и интерферона, содержащегося в промывном растворе) и восстановленного интерферона.

Ниже приведены результаты ,зыражен- ные в процентном содержании

рН

2 3 4 5 6 7 8 9 10

0

5

0

5

Как видно из вьшеприведенных результатов, когда рН раствора неочищенного интерферона был доведен до 5-9, раствор неочищенного интерферона оставался устойчивым и восстайов- ление частично очищенного интерферона было высоким. Формула изобретения

Способ очистки человеческого -интерферона путем контактирования.раствора неочищенного интерферона с сорбентом, обработки сигнала элюанТом с последующей металл-хелатной хрома- тографией полученного элюата, при которой носитель содержит хепатообра- зующий остаток, а в качестве иона - Со или N1 или Zn и элюции целевого продукта гистидином или кис- лотрым буферным раствором, отличающийся тем, что, с целью повышения производительности процесса, в качестве сорбента используют синий агарозный гель, а контактирование проводят при рН 5-9 о

Т а б л и ц а 1

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для очистки человеческого β-интерферона. Цель - повышение производительности процесса. Раствор сырого интерферона пропускают через обездвиженный синий агарозный гель, элюируют и элюат дополнительно пропускают через хелатметаллический носитель с остатком хелатирования, включающим по меньшей мере ион одного металла из группы CO⁺², NI⁺², ZN⁺². PH контактирования с синим агарозным гелем 5-9.

сть -

р

а та

30,000 186

32,000 320 280 300

285 285 300

50 10 20 30

3

0,2 1,4 150

143

5

0,6

10 60 64 124

81

32 34 10

630

570 20 15 15

14

7

4

1,0 0,16 1,2

3,010

1,0-10

2,5-1р 6-10 4-10 1,0-10

6

ы -

20,000 300

400

100

20

260

65 0,7

55

Таблица2

Т a б л и ц a 3

1200

2,

872701,0-10

740,55ЫО

Раствор сырого интерферонаПропущенный через

300

Раствор сырого интерферона. Пропущенный через

колонну

Элюирование

30%-ным раствором

этиленгликоля

40%-ным раствором

этиленгликоля

50%-ным раствором

зтиленгликоля

Таблица

ТаблицаЗ

390

15,4

2500

Таблицаб

2,5 1,6 1,7

2500 60

11 0,21 3300 42 0,15 17000 8 0,07 7100

Пропускается через + .промывка

1-я фракция элюиро- вания

2-я фракция элюирова1 ;з б л и ц а 7

Таблицав

10,3-10

1,3-10

69